The Simmons citrátový agar Jedná se o pevné médium používané jako biochemický test pro identifikaci mikroorganismů, zejména gramnegativních bacilů. Původní médium vytvořil Koser v roce 1923.
Koserovo citrátové médium sestávalo z bujónu obsahujícího fosforečnan sodný, fosforečnan amonný, fosforečnan draselný, síran hořečnatý a citrát sodný..
Jak je vidět, jediným zdrojem uhlíku v médiu je citrát a dusíku fosforečnan amonný, přičemž jako zdroj těchto prvků jsou vynechány proteiny a sacharidy, které jsou běžně přítomny v jiných médiích..
Bakterie naočkované v tomto médiu se proto mohou množit, pouze pokud je schopno přijímat uhlík z citrátu. Test byl pozitivní, pokud byl v médiu zákal, ale měl tu nevýhodu, že se mohl vyskytnout nespecifický zákal.
Tento problém vyřešil Simmons přidáním bromthymolové modři a agaru do Koserova původního vzorce. Ačkoli je princip stejný, je vykládán odlišně.
Rejstřík článků
Některé bakterie mají schopnost přežít v nepřítomnosti fermentace nebo produkce kyseliny mléčné a potřebují získávat energii pomocí jiných substrátů. V tomto testu je jediným nabízeným zdrojem uhlíku citrát.
Bakterie, které jsou schopné přežít za těchto podmínek, rychle metabolizují citrát alternativní cestou k tradiční metodě pomocí cyklu trikarboxylové kyseliny nebo cyklu citrátové fermentace..
Katabolismus citrátu bakteriemi zahrnuje enzymatický mechanismus bez zásahu koenzymu A. Tento enzym je známý pod názvem citrikáza (citrát oxaloacetát lyáza) nebo citrát desmoláza. Reakce vyžaduje přítomnost dvojmocného kationtu, který je v tomto případě dodáván hořčíkem.
Při reakci se vytvoří oxaloacetát a pyruvát, které pak způsobují vznik organických kyselin uprostřed alkalického pH, které se tvoří za použití zdroje dusíku. Tyto organické kyseliny se používají jako zdroj uhlíku, který generuje uhličitany a hydrogenuhličitany a dále alkalizuje životní prostředí..
Simmonsovo citrátové médium by mělo být lehce naočkováno do rybího ocasu pomocí přímé smyčky nebo jehly a inkubováno po dobu 24 hodin při teplotě 35-37 ° C. Po uplynutí doby jsou výsledky pozorovány.
Výsev se provádí pouze na povrchu agaru. Nepropichujte.
Pokud médium zůstane původní barvou (zelené) a nedochází k žádnému viditelnému růstu, je test negativní, ale pokud médium zmodrá, znamená to přítomnost alkalických produktů, což je detekováno indikátorem pH. V tomto případě je test pozitivní.
Stává se to proto, že pokud bakterie používá uhlík z citrátu, je také schopna přijímat dusík z fosforečnanu amonného, kterým uvolňuje amoniak, a alkalizovat médium..
Na druhou stranu, pokud je v médiu pozorován růst bakterií, ale nedochází ke změně barvy, musí být test také považován za pozitivní, protože pokud dojde k růstu, znamená to, že bakterie dokázaly použít citrát jako zdroj uhlíku , i když v tuto chvíli nedojde ke změně pH (někdy to může nějakou dobu trvat).
Pokud existují pochybnosti o interpretaci konečné barvy, lze ji porovnat s neinokulovanou citrátovou zkumavkou.
Naváží se 24,2 g dehydratovaného média na jeden litr vody. Promíchejte a nechte asi 5 minut odpočívat. Dokončete rozpuštění média zahřátím po dobu 1 nebo 2 minut za častého protřepávání.
Nalijte 4 ml do zkumavek a 15 minut autoklávujte při 121 ° C. Při opouštění autoklávu nakloňte pomocí podpěry tak, aby agar ztuhl ve tvaru zobákového zobáku s malým blokem nebo dnem a více úkosem.
Konečné pH citrátového média je 6,9 (zelená barva). Toto médium je velmi citlivé na změny pH.
Při pH 6 nebo nižším médium zezelená. Tato barva není při testu s bakteriemi pozorována.
A při pH 7,6 nebo vyšším se médium změní na hlubokou pruskou modrou barvu..
Simmons citrátový agar se používá k identifikaci určitých mikroorganismů, zejména bacilů patřících do čeledi Enterobacteriaceae a dalších bacilů, které nefermentují glukózu..
Simmonsovo citrátové médium je velmi choulostivý test, protože pokud dojde k určitým chybám, lze získat falešně pozitivní výsledky..
Je třeba dbát na následující:
Nemělo by se vyrábět velmi silné nebo nabité bakteriální inokulum, protože to může způsobit, že se v místě výsadby vytvoří měděně žlutá barva, aniž by to ovlivnilo zbytek média, ale může to vést k domněnce, že dochází k růstu. Neznamená to pozitivitu testu.
Stejně tak silné inokulum může generovat falešně pozitivní výsledky, protože předem vytvořené organické sloučeniny uvnitř buněčných stěn umírajících bakterií mohou uvolňovat dostatek uhlíku a dusíku, aby se ukazatel pH změnil..
Ideální je proto vysít jehlou místo platinové rukojeti, aby se zabránilo přebytečnému materiálu.
Na druhou stranu, když je zaseta baterie biochemických testů pro identifikaci dotyčného mikroorganismu, je důležité, aby byl jako první naočkován citrátový test, aby se zabránilo přenosu proteinů nebo sacharidů z jiného média ..
Za těchto okolností je možné dosáhnout falešně pozitivního výsledku, protože jakákoli z těchto látek, které jsou zaváděny omylem, bude metabolizována a způsobí změnu pH..
Dalším způsobem, jak se vyhnout přenosu látek, je dobře spálit smyčku a provést nové inokulum mezi jednotlivými testy..
Rovněž je třeba postupovat opatrně při dotyku s kolonií, aby se provedlo inokulum, protože je třeba se vyhnout tažení části agaru z kultury, z níž bakterie pocházejí, kvůli výše vysvětlenému.
V tomto smyslu doporučují Matsen, Sherris a Branson před inokulací citrátovým testem ředit inokulum ve fyziologickém roztoku, aby se zabránilo přenosu jiných zdrojů uhlíku.
Je třeba vzít v úvahu, že intenzita barvy produkované při pozitivním testu se může lišit podle obchodního domu.
Kromě toho existují mikroorganismy, které mají pozitivní test po 24 hodinách, ale existují i jiné kmeny, které vyžadují 48 hodin nebo více, aby došlo ke změně pH..
Zatím žádné komentáře