The agar M.R.S. je selektivní pevné kultivační médium, které se používá k izolaci a počítání bakterií mléčného kvašení, zejména rodu Lactobacillus. Tento agar vytvořili v roce 1960 Man, Rogosa a Sharpe se stejným názvem, ale kvůli jeho složitosti se často používá zkratka M.R.S..
Skládá se z proteosového peptonu, masového extraktu, kvasnicového extraktu, glukózy, sorbitanmonoleátu, fosforečnanu draselného, octanu sodného, citronanu amonného, síranu hořečnatého, síranu manganatého a agaru..
Toto složení umožňuje správný vývoj bakterií mléčného kvašení z klinických vzorků, jako jsou výkaly, vaginální výtoky, vzorky orální a mateřské mléko, jakož i mléčné a masné potraviny.
V klinických laboratořích se běžně nepoužívá, protože bakterie mléčného kvašení se zřídka účastní chorobných procesů. V oblasti potravinářské mikrobiologie je však použití agaru M.R.S častější..
Na druhé straně toto médium používají některá výzkumná centra, jejichž cílem je studium bakterií mléčného kvašení..
Rejstřík článků
Muž, Rogosa a Sharpe agar mají poměrně složité složení. Rozbitím funkce každé z jeho složek lze vysvětlit její základ.
Proteózový pepton, masový extrakt, kvasnicový extrakt a glukóza jsou živiny, které poskytují zdroj uhlíku, dusíku, vitamínů a minerálů nezbytných pro růst bakterií. Kromě toho je glukóza univerzálním zdrojem energie používaným ve většině kultivačních médií..
Na druhou stranu je pro podporu růstu bakterií mléčného kvašení nezbytná přítomnost kofaktorů (kationtů) nezbytných v metabolismu Lactobacillus a souvisejících bakterií; tyto sloučeniny jsou soli sodíku, hořčíku a manganu.
Podobně jsou sorbitanmonoleát nebo polysorbát 80 důležitým zdrojem mastných kyselin, protože jsou absorbovány jako živiny..
Kromě toho sorbitanmonoleát a citronan amonný působí inhibicí vývoje doprovodné flóry, zejména gramnegativních bakterií, což poskytuje selektivní charakter tohoto agaru..
Nakonec agar-agar je ten, který médiu poskytuje pevnou konzistenci.
Existují i jiné varianty agaru Man Rogosa Sharpe; jeden z nich je doplněn cysteinem (M.R.S.c), velmi užitečným pro izolaci bifidobakterií, mimo jiné mikroorganismy. Na druhou stranu existuje médium MRS doplněné neomycinem, paromomycinem, kyselinou nalidixovou a chloridem lithným, zejména pro selektivní počítání bifidobakterií v mléčných výrobcích..
Naváží se 68,25 gramů dehydratovaného média a rozpustí se v jednom litru destilované vody. Necháme 5 minut stát. Chcete-li se úplně rozpustit, otočte za častého míchání na zdroj tepla a vařte 1 až 2 minuty. Sterilizujte v autoklávu při 121 ° C po dobu 15 minut.
Při opouštění autoklávu nechejte několik minut odstát a ještě horký jej rozdělte do sterilních Petriho misek..
Nechte destičky ztuhnout a destičky obraťte, objednávejte v regálech na talíře a až do použití je vložte do chladničky. Před použitím nechte destičky ohřát na pokojovou teplotu.
Hodnota pH média by měla být 6,4 ± 0,2. Některé komerční domy doporučují pH mezi 5,5 až 5,9.
Dehydratované médium je béžové a připravené je tmavě jantarové.
Dehydratované médium i připravené destičky by měly být skladovány při teplotě 2 až 8 ° C..
M.R.S. Mohou být zasety na povrch (vyčerpáním nebo špachtlí Drigalski). Může být také zaseto do hloubky. Destičky by měly být inkubovány při 37 ° C v mikroaerofilitě (4% Odva a 5-10% COdva) po dobu 24 až 72 hodin.
Metoda setí se volí podle sledovaného účelu (izolace nebo počítání).
Předpokládané kolonie Lactobacillus rostou bělavě a mají na tomto agaru mukoidní nebo krémový vzhled. Později musí být identifikovány.
K tomu se používá povrchové setí. Vzorky k zasetí vyžadují předchozí postup.
V případě vzorků mateřského mléka se doporučuje odstředit 1 ml vzorku při 14 000 ot / min po dobu 10 minut, aby se odstranila tuková vrstva. 900 ul se vyhodí a ve zbývajících 100 ul se peleta suspenduje a nalije na povrch M.R.S. Poté by měl být rovnoměrně rozložen špachtlí Drigalski..
V případě vzorků stolice se jeden (1) gram stolice zváží a homogenizuje v 9 ml 0,1% sterilní vody s peptonem, což odpovídá ředění 1/10. Poté se provede sériové ředění až do konečného ředění 10-4.
Nakonec se odebere 100 μl z 10 ředění-dva, 10-3 a 10-4 a každé ředění se naočkuje na MRS agar a rovnoměrně se rozdělí pomocí špachtle Drigalski.
V tomto případě se setí provádí do hloubky.
U vzorků mateřského mléka se odebere 1 ml a umístí se do sterilní kónické plastové zkumavky. MRS agar se přidá při přibližné teplotě 40 ° C do konečného objemu 25 ml, čímž se získá homogenní směs. Následně se nalije do sterilních Petriho misek jednotným způsobem a nechá se stát až do polymerace..
U vzorků stolice se provádí ředění, jak bylo popsáno výše. Vezměte 1 ml každého ředění a vložte jej do sterilních kónických plastových zkumavek. Roztavený MRS agar se přidá do objemu 25 ml.
Směs z každého ředění se nalije rovnoměrně do sterilních Petriho misek. Nakonec se nechá odpočívat až do jeho polymerace.
Každý den si studium bakterií mléčného kvašení získává větší zájem; Vědci se zejména snaží dozvědět mimo jiné o nových kmenech a jejich potenciálu jako startovacích fermentů pro standardizaci při výrobě mléčných výrobků..
V tomto smyslu Alvarado et al. (2007) použili M.R.S. provést studii, ve které izolovali, identifikovali a charakterizovali bakterie mléčného kvašení přítomné v řemeslném andském uzeném sýru z Venezuely.
V sýru zjistili přítomnost bakterií rodů Lactococcus a Lactobacillus a dospěli k závěru, že směsi izolovaných kmenů jsou vhodné jako startovací kmeny při výrobě sýra z pasterizovaného mléka..
Na druhou stranu Sánchez a kol. (2017) použili M.R.S. zkoumat přítomnost bakterií mléčného kvašení v zažívacím traktu selat s cílem jejich použití jako nativních probiotik, která zvyšují produktivitu zdravých selat.
S tímto médiem se jim podařilo izolovat čtyři druhy: Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus brevis, Enterococcus hirae Y Pediococcus pentosaceus.
Podobně Báez et al. (2019) použitý M.R.S. vyhodnotit bakterie mléčného kvašení (LAB) a bifidobakterie s probiotickým potenciálem v mateřském mléce a kojeneckých výkalech.
Podařilo se jim izolovat 11 BAL a 3 Bifidobacteria sp v mateřském mléce a 8 BAL a 2 Bifidobacteria sp. ve výkalech. Všechny splňovaly určité parametry, které je dokazují jako bakterie s probiotickou aktivitou.
Autoři dospěli k závěru, že mateřské mléko i výkaly výlučně kojených dětí slouží jako přírodní zdroje probiotických bakterií..
Vyhodnotit kvalitu M.R.S. Kontrolní kmeny, jako například:
Lactobacillus fermentum ATCC 9338, Lactobacillus casei ATCC 393, Bifidobacterium bifidum ATCC 11863, Lactobacillus plantarum MKTA 8014, Lactobacillus lactis MKTA 19435, Pediococcus damnosus MKTA 29358, Escherichia coli a Bacillus cereus.
Očekávanými výsledky jsou uspokojivý růst pro prvních 6 bakterií E-coli Y Bacillus cereus musí být zcela potlačeno.
Zatím žádné komentáře