Malonátový vývar, příprava a použití

3276
Philip Kelley

The malonátový vývar Jedná se o kapalné kultivační médium používané pro diagnostický test (malonátový test), které se používá k rozlišení některých rodů čeledi Enterobacteriaceae. Byl vytvořen Leifsonem v roce 1933 a později upraven Ewingem, který do původního vzorce přidal malé množství dextrózy a kvasnicového extraktu..

Médium je v současné době složeno z kvasnicového extraktu, síranu amonného, ​​fosforečnanu draselného, ​​fosforečnanu draselného, ​​chloridu sodného, ​​malonátu sodného, ​​dextrózy a bromthymolové modři. Tento test je obecně součástí biochemické identifikační baterie pro Enterobacteriaceae, což pomáhá rozlišovat určité rody a druhy..

Grafické znázornění malonátového testu. A. Negativní test, B. (Okyselení) Negativní test, C. (Střední alkalizace) Pozitivní test. Zdroj: Barevné tuby publicdomainpictures.net

Test malonátu je založen hlavně na schopnosti některých mikroorganismů používat malonát sodný jako svůj jediný zdroj uhlíku a síran amonný jako svůj zdroj dusíku..

Test malonátu je obvykle pozitivní u některých druhů rodů Enterobacter, Klebsiella a Citrobacter. Vzhledem k tomu, že většina druhů rodu Escherichia, Salmonella, Shigella, Edwardsiella, Yersinia, Serratia, Morganella, Proteus a Providencia působí negativně.

Rejstřík článků

  • 1 Odůvodnění
    • 1.1 Výklad
  • 2 Příprava
    • 2.1 Malonátový vývar
    • 2.2 Malonátový bujón fenylalaninu
  • 3 Použijte
    • 3.1 Postup
  • 4 Kontrola kvality
  • 5 Omezení
  • 6 Reference

Základ

Zkouška malonátu spočívá v prokázání bakterií, které jsou schopné používat malonát sodný jako jediný zdroj uhlíku a síran amonný jako zdroj dusíku..

Většina enterobakterií, které nepoužívají malonát, je schopna růst v tomto médiu, přičemž jako živiny bere dextrózu a kvasnicový extrakt..

V tomto případě bude jakýkoli pokus o alkalizaci použitím peptonů potlačen produkcí kyselin generovaných fermentací dextrózy. Podobně působí fosforečnany dvojdraselné a monodraselné jako pufr, který udržuje pH na 6,7.

Proto, když je test negativní, zůstane vývar stejné původní barvy (zelená). Ve vzácných případech může médium okyselit kvůli fermentaci dextrózou; bez použití peptonů a indikátoru pH by se barva média změnila na žlutou. Aby k tomu došlo, musí pH klesnout na 6.

Nyní, když je tento test pozitivní, se říká, že mikroorganismus použil malonát a síran amonný jako zdroje uhlíku a dusíku, aniž by použil ostatní složky..

V tomto případě se médium zalkalizuje v důsledku uvolňování sodíku a následné tvorby NaOH. V tomto smyslu indikátor pH (bromthymolová modrá) změní barvu média ze zelené na modrou, když je pH rovno nebo vyšší než 7,6. Modrá může být světlá nebo intenzivní (pruská modrá).

Nakonec chlorid sodný udržuje osmolaritu média a voda je ředidlem všech složek..

Výklad

Stejný barevný vývar (zelený) - negativní test

Žlutý vývar: negativní test

Světlý nebo tmavomodrý vývar: pozitivní test

Existuje varianta zvaná fenylalanin malonátový vývar, nazývaná také Shawovo a Clarkeovo médium. V tomto případě lze analyzovat dva testy, použití malonátu jako zdroje uhlíku a produkci kyseliny pyrohroznové z fenylalaninu..

Příprava

Malonátový vývar

Zváží se počet gramů specifikovaný vložkou vybrané obchodní společnosti (může se lišit od jednoho k druhému). Navážené gramy se suspendují v jednom litru destilované vody. Mírně zahřejte, dokud se úplně nerozpustí. Rozdělte 3 ml média do 13/100 zkumavek s bavlněnými čepičkami..

Sterilizujte v autoklávu při 121 ° C po dobu 15 až 20 minut.

Před použitím ochlaďte. Pokud nebudou použity okamžitě, uchovávejte až do použití v chladničce. Před očkováním přiveďte vývary na pokojovou teplotu.

PH média by mělo být 6,7 ± 0,2. Barva připraveného média je láhev zelená.

Fenylalanin Malonate Broth

Naváží se 11 g dehydratovaného média a rozpustí se v 1 litru destilované vody. Zbytek přípravku je stejný jako dříve popsaný.

Může být také připraven přidáním 2 g / l fenylalaninu do média malonátového bujónu před jeho sterilizací..

Použití

Používá se jako součást baterie biochemických testů, které jsou sestaveny pro identifikaci bakterií z čeledi Enterobacteriaceae.

Pomáhá rozlišovat mezi:

-Rod Klebsiella a Enterobacter (+) rodu Escherichia a Serratia (-).

-Druhy Salmonella enterica ssp arizonae, Salmonella enterica ssp salám a Salmonella enterica ssp diarizonae (+), druhu Salmonella enterica ssp enterica (-).

-Rodu Klebsiella obvykle (+) rodu Actinobacillus (-).

-Někdy může pomoci odlišit rody a druhy bakterií, které nepatří do rodiny Enterobacteriaceae, například mezi nefermentujícími gramnegativními tyčinkami. Alcaligenes faecalis (+) a Acinetobacter sp (-).

Zdroj: Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiologická diagnostika. 5. vyd. Redakční Panamericana S.A. Argentina.

Proces

Pod zapalovač se odebírá část čistého kolínské vody pomocí řádně sterilizované a chlazené platinové rukojeti. Odebraný vzorek (lehké inokulum) se rozpustí v malonátovém bujónu. Inkubujte s víčkem uvolněným na aerobióze při 35 ° C ± 0,2 po dobu 24 až 48 hodin.

Malonátový bujón lze také naočkovat z 18-24 hodinové kultury v sójovém bujónu tryptikázy. V tomto případě se odebere 0,01 ml sterilní pipetou a naočkuje se malonátový bujón. Inkubujte s víčkem uvolněným na aerobióze při 35 ° C ± 0,2 po dobu 24 až 48 hodin.

Na konci času jsou výsledky interpretovány. Jakákoli stopa modré barvy po 48 hodinách inkubace by měla být považována za pozitivní. Test by neměl být interpretován jako negativní, dokud neuplyne 48hodinová inkubační doba..

V případě použití varianty bujónu s fenylalanin-malonátem se nejprve interpretuje malonát a poté se přidá 5 kapek 1N HC1 a 3 - 5 kapek 8% chloridu železitého. Tmavě zelená barva je interpretována jako pozitivní test na fenylalanin. Pokud naopak médium zbledne modře, je test na fenylalanin negativní..

QA

K provedení kontroly sterility média by měl být jeden nebo dva bujóny inkubovány při teplotě 35 ° C ± 0,2 po dobu 24 hodin inkubace. Po této době by nemělo dojít k žádnému zakalení nebo změně barvy.

Ke kontrole kvality lze použít známé nebo certifikované kmeny, například: Enterobacter aerogenes ATCC 13048, Klebsiella pneumoniae ATCC 33945, Salmonella enterica ssp arizonae ATCC 13314 a Escherichia coli ATCC 25922.

Očekávané výsledky jsou:

  • Enterobacter aerogenes, Klebsiella pneumoniae Y Salmonella enterica ssp arizonae dát pozitivní reakci (napůl modrá barva).
  • V následujících situacích Escherichia coli výsledek by měl být negativní, to znamená, že se očekává, že nedojde ke změně barvy (zelená) nebo že z důvodu fermentace glukózy zezelená.

Omezení

Nepoužívejte vývar, který vykazuje zákal, sraženiny, změnu barvy nebo známky poškození.

Reference

  1. Pedraza J, Sanandres N, Varela Z, Aguirre E, Camacho J. Mikrobiologická izolace Salmonella spp. a molekulární nástroje pro jeho detekci. Uninorte Health. Barranquilla (pl.) 2014; 30 (1): 73-94. K dispozici na: scielo.org.co
  2. BBL. Malonate Broth, Ewing upraven. 2007. Dostupné na: bd.com
  3. Laboratoře Senna. Malonato vývar. K dispozici na: cientificasenna.com
  4. RenyLab. Malonato vývar. 2013. Dostupné na: es.renylab.ind.br
  5. Mbiologická diagnostika. Malonato vývar. K dispozici na: mbiolog.com
  6. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiologická diagnostika. 5. vyd. Redakční Panamericana S.A. Argentina.
  7. Laboratoře Conda Pronadisa. Bujón s fenylalanin malonátem. K dispozici na: condalab.com

Zatím žádné komentáře