The močovinový vývar Jedná se o kapalné kultivační médium, které se používá k prokázání přítomnosti enzymové ureázy v určitých mikroorganismech. Urease je mikrobiální enzym, který se vyrábí konstitutivním způsobem, to znamená, že je syntetizován bez ohledu na to, zda je nebo není přítomen substrát, na který působí..
Funkce ureázy souvisí s rozkladem organických sloučenin. Ne všechny mikroorganismy jsou schopné tento enzym syntetizovat, proto jeho laboratorní stanovení umožňuje identifikovat určité bakteriální kmeny a dokonce rozlišovat mezi druhy stejného rodu..
Existují dva typy testu močoviny: Stuart a Christensen. Liší se složením a citlivostí. První je speciální k prokázání velkého množství ureázy produkované druhy rodu Proteus.
Druhá je citlivější a dokáže detekovat malá množství ureázy generované pozdě jinými bakteriálními rody, jako jsou Klebsiella, Enterobacter, Staphylococcus, Brucella, Bordetella, Bacillus, Micrococcus, Helicobacter a Mycobacterium.
Stuartův močovinový bujón se skládá z močoviny, chloridu sodného, fosforečnanu draselného, fosforečnanu draselného, výtažku z kvasnic, fenolové červeně a destilované vody..
Mezitím se Christensenův močovinový bujón nebo agar skládá z peptonů, chloridu sodného, fosforečnanu draselného, glukózy, močoviny, fenolové červeně, destilované vody a agaru. Druhá možnost pouze v případě, že se jedná o pevné médium.
Rejstřík článků
Enzym ureáza hydrolyzuje močovinu za vzniku oxidu uhličitého, vody a dvou molekul amoniaku. Tyto sloučeniny reagují za vzniku konečného produktu zvaného uhličitan amonný..
Stuartův močovinový bujón je více pufrován s pH 6,8. Mikroorganismus proto musí být schopen tvořit velké množství amoniaku, aby se stal fenol červeně. Hodnota pH by měla stoupnout nad 8.
Stuartův močovinový bujón je proto selektivní pro druhy Proteus a poskytuje pozitivní výsledky do 24 až 48 hodin po inkubaci a není účinný pro bakterie, které produkují nízké množství ureázy nebo které pomalu hydrolyzují močovinu..
Je to proto, že druhy Proteus jsou schopny využívat močovinu jako zdroj dusíku. Místo toho jiné bakterie produkující ureázu potřebují další zdroj.
Pérez a kol. (2002) zjistili, že Stuartův močovinový bujón byl stejně účinný jako Christensenův močovinový agar, pro stanovení ureázy v kmenech kvasinek rodů Candida, Cryptococcus, Rhodotorula, Trichosporon a Saccharomyces.
Autoři studie tvrdí, že dosáhli 100% shody s oběma médii (Stuart a Christensen) při inkubaci po dobu 24 a 48 hodin; s tou výjimkou, že kmeny, které dokázaly média změnit na silnou růžovo-fuchsiovou barvu, byly brány jako pozitivní.
Toto objasnění je nutné, protože Lodder (1970) uvedl, že téměř všem kvasinkám se podaří změnit zkosení Christensenova močovinového agaru na světle růžovou. To je způsobeno skutečností, že mohou hydrolyzovat močovinu v nepatrném množství, a díky tvorbě aminů oxidativní dekarboxylací aminokyselin na povrchu. To by nemělo být vykládáno jako pozitivní.
Christensenův močovinový bujón nebo agar je méně pufrovaný a je schopen detekovat malé množství amoniaku. Dále je toto médium obohaceno o peptony a glukózu. Tyto sloučeniny způsobují růst dalších mikroorganismů produkujících ureázu, které nerostou v bujónu Stuart..
Podobně test močoviny v Christensenu nabízí rychlejší výsledky, zejména pro Proteus, který je schopen poskytnout silně pozitivní pouze za 30 minut jako minimální čas a až 6 hodin jako maximální čas.
Zbytek mikroorganismů produkujících ureázu dokáže mírně změnit barvu média po 6 hodinách a silně po 24, 48, 72 hodinách nebo více, a dokonce i některé kmeny mohou po 5 nebo 6 dnech slabě reagovat..
Médium má původně žlutooranžovou barvu a pozitivní reakce změní barvu média na růžově-fuchsiovou. Intenzita barvy je přímo úměrná množství produkovaného amoniaku.
Negativní reakce ponechá médium původní barvy s výjimkou kvasinek, které se mohou na Christensenově močovinově agarovém médiu zbarvit světle růžově..
Odvážte potřebné gramy podle údajů obchodní společnosti. Rozpusťte nejlépe ve sterilní destilované vodě. K rozpuštění nepoužívejte teplo, protože močovina je na teplo citlivá.
Ke sterilizaci se používá metoda membránové filtrace. K tomu se používá filtr Millipore s póry o průměru 0,45 µ. Nepoužívejte autokláv. Jakmile je roztok filtrován, je distribuován do sterilních zkumavek. Chcete-li získat spolehlivé výsledky, měl by být převeden mezi 1,5 ml jako minimální množství a 3 ml jako maximální množství na zkumavku..
Uchovávejte v chladničce a před použitím zahřejte..
Pokud není k dispozici metoda filtrace, mělo by být médium okamžitě použito pro spolehlivé výsledky..
Další způsob, jak připravit Stuartův močovinový vývar, je následující:
Některé komerční domy prodávají základní médium pro test močoviny, bez močoviny..
Zváží se množství uvedené obchodní společností. Rozpustí se v destilované vodě a sterilizuje se v autoklávu při teplotě 121 ° C po dobu 15 minut. Nechejte trochu odpočinout a když je médium teplé, přidejte 100 ml roztoku močoviny připraveného na 20% a sterilizovaného filtrací..
Je distribuován ve sterilních zkumavkách, jak bylo popsáno výše.
Naváží se 29 g dehydrované močoviny a rozpustí se ve 100 ml destilované vody. Ke sterilizaci použijte filtrační metodu. Neautoklávujte.
24 g dehydratovaného základního agaru se rozpustí v 950 ml destilované vody. Sterilizujte v autoklávu při teplotě 121 ° C po dobu 15 minut. Nechejte stát, dokud nedosáhne teploty 50 ° C, a přidejte předem připravenou močovinu asepticky.
Nalijte 4 až 5 ml do sterilních zkumavek a nakloňte je, dokud nejsou pevné. Měl by tam být dlouhý zobák.
Toto médium lze také připravit v kapalné formě.
Test močoviny je extrémně účinný při odlišení rodu Proteus od jiných rodů čeledi Enterobacteriaceae, vzhledem k rychlé reakci, kterou Proteus poskytuje..
Použitím Christensenova složení pomáhá test rozlišovat mezi druhy stejného rodu. Například, S. haemolyticus a S. warneri sna Staphylococcus koaguláza negativní a beta-hemolytická, ale liší se v tom S. haemolyticus je močovina negativní a S. warneri je pozitivní na močovinu.
Na druhou stranu McNulty úspěšně použil Christensenův 2% močovinový bujón ke studiu přítomnosti Helicobacter pylori v bioptických vzorcích odebraných ze žaludeční sliznice (antrální oblast).
Přítomnost někoho H. pylori o tom svědčí pozitivní test močoviny. Doba pozorování výsledků je přímo úměrná množství přítomných mikroorganismů.
Jak je vidět, je to jednoduchá metoda pro diagnostiku Helicobacter pylori v biopsiích žaludku.
Nakonec je tento test také užitečný k rozlišení druhů rodu Brucella, Bordetella, Bacillus, Micrococcus a Mycobacteria..
Obě metody vyžadují pro optimalizaci výsledků silné mikrobiální inokulum. Bakteriální kolonie se s výhodou vyjímají z krevního agaru a kvasinky z agaru Sabouraud, až na několik výjimek. Inokulum se emulguje v kapalném médiu.
U močovinového bujónu Stuart inkubujte 24 až 48 hodin při 37 ° C s vědomím, že hledáte kmeny rodu Proteus, pouze pokud je kmen bakterií. U kvasinek může být inkubován při 37 ° C nebo při pokojové teplotě po dobu 24 až 48 hodin inkubace.
V případě Christensenova močovinového bujónu se inkubuje 24 hodin při 37 ° C. Pokud je test negativní, lze jej inkubovat až 6 dní. Pokud je test pozitivní před 6 hodinami, znamená to, že se jedná o kmen rodu Proteus.
V případě Christensenova močovinového agaru je zkosení agaru silně naočkováno, aniž by došlo k propíchnutí. Bujón je inkubován a interpretován stejným způsobem.
Kontrolní kmeny, jako je Proteus mirabilis ATCC 43071, Klebsiella pneumoniae ATCC 7006003, Escherichia coli ATCC 25922 a Salmonella typhimurium. První dva by měly dávat pozitivní výsledky a poslední dva negativní výsledky..
Zatím žádné komentáře