The proteináza K. Jedná se o enzym, který patří do skupiny serinových proteáz, to znamená, že má ve svém aktivním katalytickém centru aminokyselinu serin a má funkci štěpení peptidových vazeb hydrolýzou. Tento enzym zase patří do rodiny proteinů subtilisinu (peptidáza S8).
Proteináza K má molekulovou hmotnost (MW) 28 900 daltonů a byla poprvé izolována v roce 1974 v extraktech z houby Engyodontium album, dříve známý jako Tritirachium album Limber.
Má vysokou proteolytickou kapacitu, což dokazuje schopnost degradovat keratin přítomný ve vlasech. Slovo keratin v angličtině je psáno „keratin“, proto se mu říkalo „proteináza K“.
Díky své vysoké schopnosti štěpit nativní proteiny je tento enzym užitečný v různých technikách molekulární biologie. Primárně se používá k izolaci a přípravě nukleových kyselin s vysokou molekulovou hmotností (MW).
Proteináza K funguje tak, že uvolňuje jadernou DNA, přičemž ničí proteiny a inaktivuje RNázy a DNázy, to znamená, že eliminuje nukleázy v přípravcích DNA a RNA..
Na druhou stranu bylo vidět, že proteináza K může hydrolyzovat některé denaturované nativní proteiny, což vzbudilo zájem vědců o její použití při studiu prionových proteinů (PrPC).
Navzdory své vysoké proteolytické účinnosti však existují proteiny, které jsou rezistentní vůči působení proteinázy K. Mezi nimi jsou některé abnormální proteiny zvané priony (PrPSc) spojené s přenosnými spongiformními encefalopatiemi..
Rejstřík článků
Proteináza K má terciární strukturu složenou ze tří vrstev, přičemž mezi dvěma vrstvami šroubovic je vložen β list se sedmi řetězci. Protože patří do rodiny peptidů S8, vyznačuje se tím, že má ve svém aktivním místě katalytickou triádu, jejíž pořadí je (Asp, His a Ser), které je odlišuje od ostatních rodin peptidáz..
Tento enzym ze skupiny serinových proteáz se vyznačuje hydrolýzou peptidových vazeb v blízkosti karboxylové skupiny alifatických a aromatických aminokyselin..
Na druhou stranu je schopen působit v přítomnosti určitých korozivních látek, jako je dodecylsulfát sodný (SDS), Tris-HCL a EDTA, které se používají k denaturaci proteinů a způsobují ztrátu jejich přirozené struktury. ..
Toto je předběžný krok při přípravě proteinů pro techniku elektroforézy. Rozsah pH, při kterém proteináza K působí, je poměrně široký (2,0 až 12,0), s optimálním pH mezi 7,5 až 12,0 a jeho izoelektrický bod je 8,9. Jak je vidět, je aktivní proti velmi širokému rozmezí pH..
Další charakteristikou, která vyniká v proteináze K, je její stabilita za přítomnosti vysokých teplot (50 - 60 ° C)..
Proteináza K vyžaduje přítomnost vápenatého iontu, i když to neovlivňuje jeho aktivitu, pokud je nezbytné udržovat jeho stabilitu.
Aby proteináza K plně strávila substrát, je nutná kontaktní doba přibližně 5 minut až 2 hodiny..
V tomto smyslu však Daza et al. Porovnávali čistotu DNA získané při různých expozičních dobách proti proteináze K a dospěli k závěru, že prodloužená inkubace (až 24 hodin) významně zlepšuje kvalitu DNA..
Nyní, ve vztahu ke koncentraci enzymu proteinázy K použité v různých protokolech, lze říci, že je velmi různorodá.
Lze jej použít od velmi nízkých koncentrací (5 µg / ml) do koncentrací 500 µg / ml. Nejčastější pracovní koncentrace se však pohybují od 50 do 100 μg / ml, zejména pro trávení bílkovin a inaktivaci nukleáz. I když pro ošetření tkání je nutná koncentrace 2 mg / ml.
Jeho aplikace jsou velmi široké a lze je shrnout následovně:
-Používá se při trávení bílkovin a extrakci DNA různými metodami, jako jsou: solení, PK-SDS, cetyltrimethylamoniumbromid (CTAB), modifikovaný octan draselný a extrakce jodidem sodným..
-Inaktivace nukleáz (RNázy a DNázy).
-V hybridizační technice in situ (HIS), kromě uvolňování nežádoucích proteinů, napomáhá uvolňování nukleových kyselin.
-Modifikace bílkovin.
-Na úrovni výzkumu, v různých studiích.
Bylo provedeno několik srovnávacích studií mezi technikami extrakce DNA, které používají Proteinázu K, s jinými, které ji nepoužívají, a všechny dospěly k závěru, že při použití enzymu existují větší výhody. Mezi výhody patří:
-Získá se DNA o vysoké molekulové hmotnosti, vysoké kvalitě a čistotě.
-Extrahovaná DNA je stabilní až 3 měsíce.
Extrahovanou DNA lze použít v následujících technikách: Southern blot, polymerázová řetězová reakce (PCR), elektroforéza, mimo jiné..
Různé výzkumy dospěly k závěru, že priony (abnormální toxické proteiny PrPSc) se liší od PrPC (nativních) proteinů tím, že jsou rezistentní vůči působení proteinázy K, zatímco PrPC jsou citlivé na jeho působení.
Jiní autoři popsali, že ve struktuře PrPSc jsou citlivé části a jiné rezistentní na proteinázu K. Obě části jsou však stejně toxické a infekční.
Na druhou stranu Bastian et al. V roce 1987 izolovali 4 proteiny o 28, 30, 66 a 76 kda z druhu Spiroplasma mirum. Bylo zjištěno, že všechny jsou rezistentní vůči působení proteinázy K a také vykazují zkříženou reakci s některými priony..
Je známo, že tento druh může způsobit šedý zákal a významné neurologické poškození a vzhledem k Bastianovým vědeckým poznatkům byl mimo jiné proveden pokus spojit tento mikroorganismus s přenosnými spongiformními encefalopatiemi.
Etiologie této degenerativní neurologické patologie se však dnes nadále přisuzuje prionům..
V tomto smyslu Butler et al. V roce 1991 identifikovali a charakterizovali třídu proteinů rezistentních na proteinázu K 40 kda ze dvou kmenů Mycoplasma hyorhinis. Tento patogen postihuje prasata a infikuje jejich tkáně, ale v tomto případě nedošlo k žádné zkřížené reakci s testovanými priony..
K objasnění mnoha neznámých v tomto ohledu je zapotřebí dalšího výzkumu.
Zatím žádné komentáře