Zdůvodnění, příprava a použití standardního účtu na agaru

3450
Robert Johnston

The standardní počet agaru Jedná se o pevné neselektivní kultivační médium určené ke kvantifikaci aerobního mikrobiálního zatížení přítomného ve vzorcích pitné vody, odpadních vod, mléčných nápojů a dalších potravin. Toto médium je také známé jako PCA agar, pro jeho zkratku v anglickém Plate Count Agar. To bylo vytvořeno v roce 1953 Buchbinder, Baris a Goldstein.

Standardní agarové médium se skládá z kvasnicového extraktu, tripteinu, glukózy, agaru a destilované vody. Tato formulace obsahuje základní výživové prvky, které umožňují rozvoj současné, nenáročné aerobní mikrobiální zátěže.

Desetinná ředění pro počítání CFU ve standardních počtech agaru. Zdroj: Quentin Geissmann [CC BY-SA 3.0 (https://creativecommons.org/licenses/by-sa/3.0)]

Protože médium neobsahuje inhibitory, mohou bakterie růst bez jakýchkoli omezení, což je ideální pro obecné počítání kolonií. Technika kvantifikace na destičce však nezjistí všechny přítomné bakterie, ale pouze ty, které jsou schopné růst za podmínek prostředí, kterým je vystaven nasazený standardní agar pro počítání..

V tomto smyslu se metoda deskové kvantifikace obecně snaží určit množství bakterií aerobního mezofilního typu, tj. Těch, které se vyvíjejí při teplotách mezi 25 a 40 ° C, s optimální růstovou teplotou 37 ° C..

Tato bakteriální skupina je velmi důležitá, protože se zde nachází většina patogenních bakterií pro člověka..

Je třeba poznamenat, že někdy může být zajímavé kvantifikovat množství psychrofilních bakterií přítomných v potravinách. Jedná se o bakterie, které se vyvíjejí při nízkých teplotách (< 20°C) y son las responsables de que los alimentos se descompongan más rápido, aun estando en nevera.

Podobně mohou být termofilní bakterie, které se vyvíjejí v rozmezí 50 ° C až 80 ° C nebo více, důležité v určitých druzích potravin, jako jsou konzervy..

Mikrobiální kvantifikace je vyjádřena v jednotkách tvořících kolonie (CFU) na gram nebo mililiter vzorku.

Rejstřík článků

  • 1 Odůvodnění
  • 2 Příprava
    • 2.1 Pro techniku ​​pour-plate
    • 2.2 Pro povrchový výsev
  • 3 Použijte
    • 3.1 Technika lití na talíř (hloubkové setí)
    • 3.2 Technika výsevu povrchu
  • 4 Kontrola kvality
  • 5 Omezení
  • 6 Reference

Základ

Standardní médium pro počítání je navrženo tak, aby umožňovalo úspěšný růst nenáročných aerobních bakterií, protože kvasnicový extrakt, triptein a glukóza poskytují potřebné živiny pro dobrý mikrobiální růst..

Na druhé straně má médium světlou barvu a průhledný vzhled, a proto je ideální pro vizualizaci kolonií vyvinutých metodou hlubokého setí (nalití talíře)..

Počítání kolonií metodou setí povrchu špachtle Drigalski je také možné..

Je-li mikrobiální zátěž vysoká, musí být provedena desetinná ředění zkoumaného vzorku, aby bylo možné počítat CFU.

Je třeba poznamenat, že toto médium doporučuje Americká asociace veřejného zdraví (APHA) pro počet aerobních mezofilů..

Příprava

Naváží se 23,5 g dehydratovaného média a rozpustí se v jednom litru destilované vody. Aby se směs úplně rozpustila, měla by se zahřívat častým mícháním, dokud se nerozvarila. Další kroky závisí na použité technice očkování.

Pro techniku ​​pour-plate

Rozdělte dávkováním 12 až 15 ml do zkumavek. Následně sterilizujte v autoklávu po dobu 15 minut při teplotě 121 ° C. Nechte svisle ztuhnout ve tvaru bloku. Uchovávejte v chladničce až do použití.

Pokud ji chcete použít, roztavte ji. Jakmile se roztaví, udržujte jej ve vodní lázni při teplotě 44-47 ° C, zatímco se vzorky připravují..

Pro povrchový výsev

Sterilizujte médium v ​​autoklávu při 121 ° C a poté rozdělte 20 ml do sterilních Petriho misek. Nechejte ztuhnout, převraťte a uložte do chladničky až do použití.

Před použitím desky temperujte. PH média musí být 7,0 ± 0,2.

Použití

Standard Count Agar se používá v aerobní technice počítání mezofilů během mikrobiologické analýzy vody a potravin. Počet aerobních mezofilů je nezbytný, protože určuje hygienickou kvalitu studovaného vzorku..

Aplikace této techniky (pomocí tohoto média) umožňuje makroskopickou vizualizaci izolovaných kolonií pro jejich kvantifikaci..

Technika lití talířů (hloubkové setí)

-Proces

Tato technika se skládá z následujících prvků:

1) Homogenizujte vzorek, aby se redistribuovaly přítomné bakterie.

2) Počáteční suspenze se připraví ve sterilní lahvičce nebo vaku, při dodržení poměru 10 g nebo 10 ml vzorku v 90 ml ředidla (10-1).

3) Z počáteční suspenze se provedou příslušná desetinná ředění v závislosti na typu vzorku. Příklad: (10-dva, 10-3, 10-4). Ředění se provádí peptonovou vodou nebo fosfátovým pufrem..

K tomu vezměte 1 ml počáteční suspenze a vložte ji do 9 ml ředidla, pokud je to nutné, pokračujte v ředění, nyní vezměte 1 ml ředění 10-dva a tak dále.

4) Vezměte 1 ml každého ředění a vložte do prázdné sterilní Petriho misky.

5) Přidejte na každou destičku 12 až 15 ml agaru se standardním počtem, který byl předtím roztaven a usazen na 44 - 47 ° C.

6) Opatrně otáčejte destičkami, aby se vzorek rovnoměrně rozložil po agaru a nechal se ztuhnout..

7) Destičky obraťte a inkubujte při teplotě 37 ° C v aerobióze po dobu 24 až 48 hodin.

8) Na konci času se plotny zkoumají a kolonie se počítají v ředění, které to umožňuje. Pro počet jsou vybrány desky, které mají mezi 30 až 300 CFU.

Počítání lze provést ručně nebo můžete použít počítadlo kolonií.

Hodnoty povolené na ml vzorku se mohou v jednotlivých zemích lišit v závislosti na předpisech, kterými se řídí..

-Výpočet CFU

Obecný výpočet se provádí pomocí následujícího vzorce:

Vzorec pro obecný výpočet kvantifikace CFU. Zdroj: Národní správa léčiv, potravin a lékařské technologie (ANMAT). Mikrobiologická analýza potravin, oficiální analytická metodika, indikátorové mikroorganismy. 2014 Volume 3. Dostupné na: anmat.gov.ar

Výsledky vyjádřete v 1 nebo 2 číslicích vynásobením příslušnou základnou 10. Příklad: pokud je výsledek 16 545, zaokrouhlí se na základě třetí číslice na 17 000 a bude vyjádřen následovně: 1,7 x 104. Nyní, pokud byl výsledek 16 436, zaokrouhlete jej na 16 000 a vyjádřete 1,6 x 104.

Technika výsevu povrchu

-Proces

-Naočkujte 0,1 ml přímého vzorku, pokud je kapalný, počáteční suspenze 10-1 nebo 10 po sobě jdoucích ředění-dva, 10-3 atd., uprostřed standardní agarové plotny.

-Vzorek rovnoměrně rozetřete špachtlí Drigalski nebo skleněnou tyčinkou ve tvaru L. Nechejte 10 minut stát.

-Invertujte destičky a inkubujte aerobně při 37 ° C po dobu 24 až 48 hodin.

-Pokračujte v počítání kolonií, vyberte ty talíře, které jsou v rozmezí mezi 20 - 250 CFU.

-Výpočet CFU

Pro výpočet se použije zřeďovací faktor, který je inverzní. Číslo je zaokrouhleno na 2 platné číslice (zaokrouhleno podle třetí číslice) a vyjádřeno v síle báze 10. Například pokud je ve vzorku bez zředění započítáno 224 CFU (10-1), Je hlášeno 22 x 101  UFC, ale pokud bylo číslo 225, uvádí se 23 x 101 UFC.

Pokud nyní počítáte 199 CFU v ředění 10-3, bude hlášeno 20 x 104 CFU, ale pokud se počítá 153 CFU ve stejném ředění, bude hlášeno 15 x 104 UFC.

QA

Standardní kultivační médium lze vyhodnotit pomocí certifikovaných známých kmenů, například: Escherichia coli ATCC 8739, Zlatý stafylokok ATCC 6538, Bacillus subtilis ATCC 6633, Lactobacillus fermentum ATCC 9338, Staphylococcus epidermidis ATCC 12228, Shigella flexneri ATCC 12022.

Pokud je kultivační médium v ​​optimálních podmínkách, očekává se uspokojivý růst ve všech případech, s výjimkou L. fermentum který může mít pravidelné představení.

Pro vyhodnocení sterility kultivačního média by měla být jedna nebo dvě destičky každé připravené dávky (bez inokulace) inkubovány při 37 ° C v aerobióze po dobu 24 hodin. Po této době by neměl být pozorován žádný růst ani změna barvy média..

Omezení

-Nerozpouštějte agar více než jednou.

-Připravené médium může trvat až 3 měsíce, pokud je uchováváno v chladničce a chráněno před světlem..

-Toto médium není vhodné pro náročné nebo anaerobní mikroorganismy.

Reference

  1. Národní správa léčiv, potravin a medicínských technologií (ANMAT). Mikrobiologická analýza potravin, oficiální analytická metodika, indikátorové mikroorganismy. 2014 Volume 3. Dostupné na: anmat.gov.ar
  2. Laboratorios Difco Francisco Soria Melguizo, S.A. Agar s počtem desek. 2009. Dostupné na: http://f-soria.es
  3. Laboratoře Conda Pronadisa. Standardní metoda Agar (PCA) podle APHA a ISO 4833. Dostupné na: condalab.com
  4. Britannia Laboratories. Počet agarových desek. 2015. Dostupné na: britanialab.com
  5. Camacho A, Giles M, Ortegón A, Palao M, Serrano B a Velázquez O. 2009. Techniky pro mikrobiologickou analýzu potravin. 2. vyd. Fakulta chemická, UNAM. Mexiko. Dostupné na: depa.fquim.unam

Zatím žádné komentáře