Příprava, použití a použití agaru TSI

3634
Simon Doyle

The TSI agar o Triple Sugar Iron Agar je pevné kultivační médium, které slouží jako biochemický test k vedení počáteční identifikace gramnegativních bacilů. Je založen na znázornění fermentace přítomných cukrů a produkce sirovodíku a plynu.

Jeho složení a podstata je velmi podobná Kliglerovu testu na železo, s tím rozdílem, že tento obsahuje pouze glukózu a laktózu. Na druhé straně - jak již název napovídá - trojitý cukr železný agar obsahuje tři fermentovatelné sacharidy: glukózu, laktózu a sacharózu..

Obrázky testu TSI s různými mikroorganismy A. Escherichia coli, B. Shigella flexneri, C) Salmonella typhimurium, D. Pseudomonas aeruginosa. Zdroj: Witmadrid [public domain], z Wikimedia Commons

Kromě toho má médium TSI čtyři proteinové deriváty, které z něj dělají velmi výživný agar: kvasnicový extrakt, masový extrakt, pepton a peptid proteózy. Také obsahuje síran železnatý amonný, thiosíran sodný, chlorid sodný, fenolovou červeň a agar.

Neschopnost mikroorganismu fermentovat glukózu přítomnou v médiu ji okamžitě vylučuje z toho, že patří do rodiny Enterobacteriaceae. Z tohoto důvodu je tento test nezbytný při rozhodování, jakou cestou identifikace je třeba určit rod a druh..

Každá laboratoř se rozhodne, zda bude pracovat s agarem TSI nebo s agarem železa Kligler..

Rejstřík článků

  • 1 Odůvodnění
    • 1.1 Chlorid sodný a agar
    • 1.2 pH indikátor (fenolová červeň)
    • 1.3 Proteinové deriváty (kvasnicový extrakt, masový extrakt, pepton a proteózový pepton)
    • 1.4 Fermentace sacharidů (glukóza, laktóza a sacharóza)
    • 1.5 Výroba plynu
    • 1.6 Thiosíran sodný a síran železnatý amonný (výroba sirovodíku)
  • 2 Příprava
  • 3 použití
  • 4 zaseto
  • 5 Omezení
  • 6 Reference

Základ

Každá ze sloučenin plní v médiu funkci.

Chlorid sodný a agar

Chlorid sodný je nezbytný k udržení osmotické rovnováhy média. Zatímco agar mu dodává pevnou konzistenci.

Indikátor PH (fenolová červeň)

PH připraveného média je vyváženo na 7,3 a indikátor pH (fenolová červeň) zežloutne pod 6,8. To znamená, že malé množství kyselin produkovaných fermentací cukrů změní médium z červenooranžové na žlutou..

Pokud nedojde k fermentaci, dojde k alkalizaci média pomocí peptonů, které se změní z červenooranžové na silně červenou.

Proteinové deriváty (kvasnicový extrakt, masový extrakt, pepton a proteózový pepton)

Když bakterie metabolizují proteiny přítomné v agaru TSI, produkují se aminy, které alkalizují médium (hlavně na úrovni zkosení), protože reakce vyžaduje kyslík. Amini otočí rámeček jasně červeně.

To však bude záviset na schopnosti bakterií fermentovat sacharidy nebo ne..

Fermentace sacharidů (glukóza, laktóza a sacharóza)

Studie fermentace cukrů může poskytnout několik obrázků a každý z nich je interpretován odlišně. Interpretace testu rozděluje mikroorganismy do 3 kategorií: fermentory glukózy, fermentory laktózy a fermentory laktózy / sacharózy..

Je třeba poznamenat, že množství glukózy v médiu je omezené, zatímco koncentrace laktózy a sacharózy je 10krát vyšší..

Bakterie z čeledi Enterobacteriaceae a další mikroorganismy fermentující glukózu začnou tento cukr fermentovat, protože jde o nejjednodušší sacharid pro energii..

Na druhou stranu, laktóza a sacharóza jsou komplexní sacharidy, které se musí štěpit a převést na glukózu, aby mohly vstoupit do cyklu Embden-Meyerhof..

-Non-glukóza fermentující mikroorganismy

Když naočkovaný mikroorganismus není schopen fermentovat glukózu, tím méně bude schopen fermentovat další sacharidy. Proto se zde netvoří žádné kyseliny, ale v úkosu dochází k tvorbě aminů v důsledku použití peptonů.

V takovém případě se rámeček změní na silnější červenou barvu a spodní část trubice může zůstat nezměněna nebo může být také alkalizována, takže celá trubice zůstane červená..

Výklad: K / K znamená alkalické zkosení / alkalické nebo neutrální dno

Na obrázku na začátku článku viz obrázek trubice D..

Tento výsledek naznačuje, že mikroorganismus nepatří do čeledi Enterobacteriaceae..

-Laktóza / sacharóza nefermentující mikroorganismy

Pokud jsou bakterie schopné fermentovat glukózu, ale ne laktózu nebo sacharózu, stane se následující:

Bakterie spotřebují veškerou přítomnou glukózu po přibližně 6 až 8 hodinách a jsou schopné okyselit jak zkosení, tak blok; to znamená, že agar zcela zežloutne. Ale když je glukóza vyčerpána a neschopnost používat laktózu a sacharózu, bakterie zahájí metabolismus bílkovin.

Tato reakce vyžaduje kyslík, proto dochází k degradaci peptonů na povrchu (zkosení). Vyrobené aminy alkalizují rámeček, který se mění ze žluté na červenou. Tato reakce je prokázána po 18 až 24 hodinách inkubace..

Interpretace: K / A znamená alkalické zkosení a kyselý svazek.

Na obrázku na začátku článku viz obrázek trubice B.

-Laktóza / sacharóza fermentující mikroorganismy

Mikroorganismy schopné fermentovat laktózu a sacharózu mohou samozřejmě fermentovat glukózu. Po vyčerpání minimálního množství glukózy přítomného v médiu se vytvořený pyruvát začne metabolizovat na kyseliny během aerobního Krebsova cyklu a v období 8 až 12 hodin bude celé médium žluté.

Pokud jsou bakterie schopné štěpit laktózu nebo sacharózu, budou se nadále tvořit kyseliny a po 18 až 24 hodinách bude celá zkumavka - zkosení a zátka - nadále žlutá.

Je třeba poznamenat, že použití glukózy se provádí dvěma způsoby: jedním aerobně na zkosení tuby a druhým anaerobně na dně tuby..

Interpretace: A / A znamená kyselé zkosení / kyselé dno. Může nebo nemusí obsahovat plyn.

Na obrázku na začátku článku vidíte obrázek trubice A.

Výroba plynu

Některé mikroorganismy jsou schopné produkovat plyn během fermentace cukrů. Plyn se v trubici projevuje tlakem, který vyvíjí v agaru. Tlak způsobuje tvorbu bublin nebo posunutí agaru. Někdy může tvorba plynu médium zlomit.

Je důležité, aby při výsevu média TSI bylo propíchnutí provedeno čistě středem agaru, dokud nedosáhne dna. Pokud je defekt odkloněn směrem ke stěnám trubice, může to způsobit falešné pozitivy při výrobě plynu, protože unikne nesprávně vytvořeným kanálem.

Produkce plynu, jakož i reakce, ke kterým dochází na agarovém úkosu, vyžadují kyslík, proto se doporučuje trubici zakrýt bavlněnou zátkou a pokud se použije čepička z bakelitu, neměla by být zcela těsná..

Produkce plynu se vykazuje jako kladná (+) nebo záporná (-).

Vzory tvorby plynu. Zdroj: Schéma vytvořené MSc. Marielsa Gil. Zdroj obrázku: VeeDunnFlickr.com/Y_tambe [CC BY-SA 3.0 (https://creativecommons.org/licenses/by-sa/3.0)], přes Wikimedia Commons

Thiosíran sodný a síran železnatý amonný (výroba sirovodíku)

Bakterie schopné produkovat sirovodík (bezbarvý plyn) absorbují síru z thiosíranu sodného přítomného v médiu. Jakmile se HdvaS reaguje se síranem železnatým amonným za vzniku sulfidu železa (jasně viditelná černá sraženina).

Výroba HdvaS se uvádí jako pozitivní (+) nebo negativní (-).

Na obrázku na začátku článku viz obrázek trubice C..

Příprava

Naváží se 62,5 g média dehydratovaného trojitého cukru a železa (TSI) a rozpustí se v jednom litru destilované vody..

Zahřívejte, dokud se agar úplně nerozpustí. Vařte za minutu za častého míchání. Rozdělte 4 ml média do 13/100 zkumavek s bavlněnými čepičkami.

Sterilizujte v autoklávu při teplotě 121 ° C po dobu 15 minut. Vyjměte z autoklávu a nechte jej ležet pod úhlem. Je třeba dbát na to, aby základna i rámeček měly stejnou vzdálenost.

Uchovávejte v chladničce 2-8 ° C. Před zasetím bakteriálního kmene nechte ohřát.

Barva dehydratovaného média je světle béžová a připravené médium je červenooranžové.

Konečné pH připraveného média je 7,3 ± 0,2.

Aplikace

Zkouška TSI je široce používána na úrovni mikrobiologické laboratoře. Tento test je nezbytný jako vodítko pro typ testu, který musí být použit pro identifikaci rodu a druhu. Jeho dobré provedení a interpretace může ušetřit materiál a práci.

Pokud je výsledkem TSI K / K a test na cytochromoxidázu je pozitivní, je známo, že by měly být použity testy pro identifikaci nefermentujících gramnegativních tyčinek, jako jsou Podymonas, Alcaligenes, Achromobacter, Burkholderia a další rody. Pokud je negativní na oxidázu, je orientována na rody Acinetobacter, Stenotrophomonas atd..

Na druhou stranu, pokud je získána TSI A / A nebo K / A a test na cytochromoxidázu je negativní, čím více dusičnanů se redukuje na dusitany, budeme si jisti, že jde o mikroorganismus patřící do rodiny Enterobacteriaceae. V tomto případě se identifikační cesta zaměří na specifické testy pro tuto skupinu bakterií..

Na druhou stranu, pokud je získán obraz K / A nebo A / A a test na cytochromoxidázu je pozitivní, další testy, které mají být sestaveny, budou zaměřeny na identifikaci fermentačních kmenů, které nepatří do čeledi Enterobacteriaceae, jako je jako: Aeromonas, Plesiomonas, Vibrio a Pasteurella.

Při identifikaci následujících rodů čeledi Enterobacteriaceae bude sloužit TSI se sirovodíkem, který je negativní na oxidázu: Proteus, Citrobacter, Edwardsiella, Leminorella, Pragia, Trabusiella nebo Salmonella.

TSI s malým nebo středním obsahem sirovodíku v alkalickém zkosení s alkalickým pozadím a pozitivní oxidázou bude vodítkem pro použití testů pro identifikaci nefermentujících gramnegativních bacilů produkujících HdvaAno, přesně jako Shewanella putrefaciens.

A konečně lze TSI použít ke zkoumání produkce sirovodíku v grampozitivních bacilech, zejména je-li podezření na ni Erysipelothrix rhusiopathiae.

Zaseto

Médium TSI musí být naočkováno čistými koloniemi, izolovanými v primárních nebo selektivních kulturách. Pokud je kolonie odebrána ze selektivního média, které bylo naočkováno vzorky se smíšenou flórou, je třeba dbát na to, aby byla odebrána pouze z povrchu, protože v dolní části kolonie mohou existovat životaschopné kmeny inhibované v tomto médiu..

Smyčka by proto nikdy neměla být ochlazována na selektivním médiu, aby bylo možné později odebrat kolonii a naočkovat médium TSI..

Výsev bude proveden přímou smyčkou nebo jehlou. Provede se propíchnutí, přičemž se bude dbát na to, aby procházelo středem středu, dokud nedosáhne dna, a poté je očkování dokončeno očkováním povrchu ve tvaru cikcaku. Neprovádějte dvě propíchnutí.

Inkubujte při teplotě 37 ° C na aerobióze po dobu 18-24 hodin. Tlumočte v této době, ani dříve, ani poté.

Omezení

Zkoušku TSI je třeba přečíst do 18 až 24 hodin po inkubaci. Čtení před touto dobou může dát falešně pozitivní výsledek pro A / A fermentaci. Zatímco čtení po této době může vést k falešně negativnímu obrazu nefermentátoru kvůli spotřebě peptonů, které alkalizují médium..

Reference

  1. Mac Faddin J. (2003). Biochemické testy pro identifikaci bakterií klinického významu. 3. vyd. Redakční Panamericana. Buenos Aires. Argentina.
  2. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Bailey & Scott mikrobiologická diagnostika. 12 ed. Redakční Panamericana S.A. Argentina.
  3. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiologická diagnostika. 5. vyd. Redakční Panamericana S.A. Argentina.
  4. „TSI agar.“ Wikipedia, The Free Encyclopedia. 10. července 2018, 08:09 UTC. 10. února 2019, 03:33 Dostupné na: es.wikipedia.org
  5. Britannia Laboratories. TSI Agar (trojitý agar se železným cukrem). 2015. Dostupné na: britanialab.com
  6. BD Laboratories. Agar trojitý cukr železo (TSI Agar). 2003. Dostupné na: bd.com

Zatím žádné komentáře