The Biuret je činidlo používané ke stanovení proteinů s dlouhým a krátkým řetězcem. Používá se zejména v oblasti analytické chemie a analýzy moči ke zkoumání koncentrace celkových proteinů v séru, plazmě a moči..
Hodnoty bílkovin lze u určitých patologií zvýšit nebo snížit. Příznaky hypoproteinemie se obvykle vyskytují u pacientů s onemocněním ledvin, u podvyživených pacientů au pacientů s chronickými infekcemi..
Zatímco hyperproteinemie je pozorována u patologických stavů, jako je mnohočetný myelom, systémový lupus erythematodes, bakteriální endokarditida, bakteriální meningitida, Waldenstromova makroglobulinemie, mimo jiné..
Na druhé straně je přítomnost bílkovin v moči způsobena filtrací albuminu ledvinami. Toto je patologické chování, které by mělo být studováno.
V tomto smyslu je Biuret velmi užitečný, protože umožňuje kvantifikovat přítomnost proteinů v séru, plazmě, moči a mnoha dalších vzorcích..
Dokonce i Biuret lze použít ke zkoumání přítomnosti a koncentrace proteinů ve špatně prozkoumaných vzorcích nebo ve vzorcích neznámého složení. Proto je široce používán v oblasti výzkumu.
Test Biuret je založen na detekci peptidových vazeb. Zkouška probíhá v alkalickém prostředí. Vzorek musí obsahovat alespoň dvě peptidové vazby, aby se vytvořil fialovo-fialový komplex. Komplex je tvořen spojením vazeb a iontu mědi.
Rejstřík článků
Biuretovo činidlo se skládá z hydroxidu draselného, síranu měďnatého a vinanu sodného a draselného. K alkalizaci média se používá hydroxid sodný, protože tato podmínka je nezbytná pro uskutečnění reakce.
Látky, které reagují s bílkovinami, jsou síran měďnatý, zatímco tartrát sodný má funkci, která neumožňuje tvorbu hydroxidu měďnatého, který má tendenci se srážet a interferuje s reakcí..
Pokud jsou ve vzorku nalezeny látky s peptidovými vazbami (polypeptidy nebo proteiny), bude test pozitivní.
Reakce se interpretuje jako pozitivní, když roztok zčervená. Barva se vyrábí tvorbou komplexu mezi alespoň dvěma peptidovými vazbami, které mají skupinu CO-NH a měďnatými kationty.
Fialový komplex může být vytvořen dvěma způsoby: jedním je ztráta protonů z amidových skupin, které se vážou na kov (depronotace), a druhým spojením volných a vázaných elektronů kyslíku a dusíku, které se vážou na měď..
Tato reakce se může lišit v intenzitě a barvě v závislosti na typu proteinu..
Zkoušku lze provést kvalitativně nebo kvantitativně. V kvalitativní formě se uvádí jako pozitivní nebo negativní. Zatímco v kvantitativní formě lze koncentraci měřit spektrofotometrickou metodou.
Reakce se čte mezi 540-560 nm. Intenzita barvy je přímo úměrná koncentraci peptidových vazeb ve vzorku..
-Hydroxid sodný (NaOH) 20%
-1% pentahydrát síranu měďnatého (CuSO4. 5HdvaNEBO)
-Smíšený tetrahydrát vinanu sodnodraselného (KNaC4H4NEBO64HdvaNEBO)
-Musí být uchováván v chladu.
-Do zkumavky vložte 100 µl vzorku nebo standardu, který se má analyzovat.
-Přidejte 2 ml hydroxidu sodného.
-Velmi dobře promíchejte.
-Přidejte 5 ml činidla Biuret.
-Promíchejte a nechte 25 minut stát při pokojové teplotě, zakryjte a chraňte před světlem.
-Pozorujte či nevytváří barvu a měřte spektrofotometricky.
K provedení kalibrační křivky lze jako standard použít hovězí sérový albumin. Připravují se z něj různé koncentrace. Například 25, 50, 75, 100, 125 a 150%.
Reakce se nastaví se všemi těmito známými koncentracemi a absorbance se odečte při vlnové délce 540 nm. Z dat známých koncentrací a odečtených hodnot absorbance se vytvoří kalibrační křivka.
U každého stanovení nebo šarže zpracovaných vzorků se doporučuje připojit standard. Jako kalibrační standard lze použít hovězí sérový albumin 0,1-2 mg / ml..
Měření se provádí na spektrofotometru při 540 nm.
Linearita je splněna až do koncentrace 12 g / dl.
I když to není příliš časté, je třeba poznamenat, že některé látky mohou během provádění této zkoušky interferovat. Například přítomnost amoniaku může bránit tvorbě barvy.
Podobně by jiné látky mohly absorbovat při stejné vlnové délce, například určité pigmenty..
Na druhou stranu může dojít k interferenci, když jiná látka než peptidová vazba vytvoří komplex s měďnatou solí. Příklad: některé sacharidy a určité lipidy.
Pokud vzorek, který má být analyzován, vykazuje určitý druh sraženiny, musí být před montáží testu filtrován nebo odstředěn..
Test není ovlivněn přítomností:
-Bilirubin až do koncentrace 20 mg / dl.
-Hemoglobin až do koncentrace 750 mg / dl.
-Dextran až do koncentrace 30 g / l.
-Triglyceridy až do koncentrace 4000 mg / dl.
-Je to jednoduchá metoda k provedení.
-Je to ekonomický test.
-Má vysokou specificitu pro proteiny.
-Malé rušení.
Má špatnou citlivost k detekci malého množství bílkovin. Práce provedená společností Fuentes a spolupracovníky potvrzuje, že testovací metoda Biuret má detekční limit 1 mg / ml proteinu a limit kvantifikace 3 mg / ml.
Jiný výzkum prováděný na univerzitě v Amazonii však uvádí mnohem nižší hodnoty. Detekční limit uváděný ve studii je 0,020 mg / ml a kvantifikační limit je 1,33 mg / ml..
Biuretovo činidlo nebo test se používá pro stanovení proteinů v klinických a neklinických vzorcích v rutinních a výzkumných laboratořích.
U mnoha patologických stavů je důležité určit koncentraci celkových proteinů v klinických vzorcích, která může být vysoká nebo nízká.
Jsou zvýšené v:
-Mnohočetný myelom,
-Systémový lupus erythematodes,
-Bakteriální endokarditida,
-Bakteriální meningitida,
Waldenstromova makroglobulinemie, mimo jiné.
Snižuje se v:
-Renální nedostatečnost,
-Lidé s těžkým stupněm podvýživy,
-Pacienti s chronickými infekcemi, mimo jiné.
Nejběžnějšími klinickými vzorky jsou sérum, plazma a moč. Normální hodnota proteinů v séru nebo plazmě je 6,0-8,8 gr / dl.
Koncentrace bílkovin v moči u dospělých nepřesahuje hodnotu 150 mg / 24 hodin.
Kojenci: < a 0,50 mg
Děti od 2 let: index: 0,20 mg
Dospělí: < 0,2 mg
Biuretovou reakci lze použít pro mnoho typů neklinických vzorků, jako jsou mléčné výrobky, antivenom nebo jakákoli neznámá látka, u které chcete zjistit přítomnost bílkovin..
Zatím žádné komentáře