The restrikční enzymy jsou endonukleázy používané určitými archeai a bakteriemi k inhibici nebo „omezení“ šíření virů v nich. Jsou obzvláště běžné v bakteriích a jsou součástí jejich obranného systému proti cizí DNA známé jako systém omezení / modifikace..
Tyto enzymy katalyzují štěpení dvoupásmové DNA na konkrétních místech, reprodukovatelně a bez použití další energie. Většina z nich vyžaduje přítomnost kofaktorů, jako je hořčík nebo jiné dvojmocné kationty, i když některé také vyžadují ATP nebo S-adenosylmethionin.
Restrikční endonukleázy objevily v roce 1978 Daniel Nathans, Arber Werner a Hamilton Smith, kteří za svůj objev obdrželi Nobelovu cenu za medicínu. Jejich název obecně pochází z organismu, kde jsou poprvé pozorovány.
Tyto enzymy jsou široce používány při vývoji metod klonování DNA a dalších strategií molekulární biologie a genetického inženýrství. Jejich specifické charakteristiky rozpoznávání sekvencí a schopnost řezat sekvence v blízkosti míst rozpoznávání z nich činí silné nástroje v genetickém experimentování..
Fragmenty generované restrikčními enzymy, které působily na konkrétní molekulu DNA, lze použít k vytvoření „mapy“ původní molekuly pomocí informací o místech, kde enzym štěpí DNA..
Některé restrikční enzymy mohou mít stejné rozpoznávací místo na DNA, ale nemusí jej nutně řezat stejným způsobem. Existují tedy enzymy, které štěpí opouštějící tupé konce, a enzymy, které krájejí opouštějící kohezní konce, které mají v molekulární biologii různé aplikace.
V současné době existují stovky různých komerčně dostupných restrikčních enzymů, které nabízejí různé komerční domy; tyto enzymy fungují jako „vlastní“ molekulární nůžky pro různé účely.
Rejstřík článků
Restrikční enzymy plní opačnou funkci polymeráz, protože hydrolyzují nebo porušují esterovou vazbu ve fosfodiesterové vazbě mezi sousedními nukleotidy v nukleotidovém řetězci..
V molekulární biologii a genetickém inženýrství jsou široce používanými nástroji pro konstrukci expresních a klonovacích vektorů a pro identifikaci specifických sekvencí. Jsou také užitečné pro konstrukci rekombinantních genomů a mají velký biotechnologický potenciál..
Nedávné pokroky v genové terapii v současné době využívají restrikční enzymy pro zavedení konkrétních genů do vektorů, které jsou nosiči pro transport těchto genů do živých buněk a které pravděpodobně mají schopnost vložit se do buněčného genomu za účelem provedení trvalých změn.
Restrikční enzymy mohou katalyzovat dvojpásmové štěpení DNA, i když některé jsou schopné rozpoznat jednopásmové sekvence DNA a dokonce i RNA. K řezu dochází po rozpoznání sekvencí.
Mechanismus účinku spočívá v hydrolýze fosfodiesterové vazby mezi fosfátovou skupinou a deoxyribózou v páteři každého řetězce DNA. Mnoho z enzymů je schopných štěpit na stejném místě, které rozpoznávají, zatímco jiné štěpí mezi 5 a 9 páry bází před nebo po stejném.
Normálně tyto enzymy štěpí na 5 'konci fosfátové skupiny, což vede k fragmentům DNA s 5' fosforylovým koncem a 3 'koncovým hydroxylovým koncem.
Protože proteiny nepřicházejí do přímého kontaktu s rozpoznávacím místem v DNA, musí být postupně translokovány, dokud není dosaženo specifického místa, snad pomocí „posuvných“ mechanismů na řetězci DNA..
Během enzymatického štěpení je fosfodiesterová vazba každého z řetězců DNA umístěna v jednom z aktivních míst restrikčních enzymů. Když enzym opustí rozpoznávací a štěpné místo, činí to prostřednictvím nespecifických přechodných asociací.
V současné době je známo pět typů restrikčních enzymů. Zde je stručný popis každého z nich:
Tyto enzymy jsou velké pentamerní proteiny se třemi podjednotkami, jednou pro restrikci, druhou pro methylaci a druhou pro rozpoznávání sekvencí v DNA. Tyto endonukleázy jsou multifunkční proteiny schopné katalyzovat restrikční a modifikační reakce, mají ATPázovou aktivitu a také DNA topoizomerázu..
Enzymy tohoto typu byly prvními endonukleázami, které byly objeveny, byly poprvé purifikovány v 60. letech a od té doby byly studovány ve velké hloubce.
Enzymy typu I nejsou široce používány jako biotechnologický nástroj, protože štěpné místo může být v proměnlivé vzdálenosti až 1 000 párů bází od rozpoznávacího místa, což je činí nespolehlivými, pokud jde o experimentální reprodukovatelnost..
Jsou to enzymy složené z homodimerů nebo tetramerů, které štěpí DNA na definovaných místech o délce 4 až 8 bp. Tato místa štěpení jsou obvykle palindromická, to znamená, že rozpoznávají sekvence, které jsou čteny stejným způsobem v obou směrech..
Mnoho z restrikčních enzymů typu II v bakteriích štěpí DNA, když rozpoznají její cizí charakter, protože nemá typické modifikace, které by její vlastní DNA měla mít.
Jedná se o nejjednodušší restrikční enzymy, protože k rozpoznávání a štěpení sekvencí DNA nevyžadují žádný jiný kofaktor než hořčík (Mg +)..
Přesnost restrikčních enzymů typu II při rozpoznávání a štěpení jednoduchých sekvencí v DNA v přesných pozicích je činí jedním z nejpoužívanějších a nepostradatelných ve většině oborů molekulární biologie..
Ve skupině restrikčních enzymů typu II existuje několik podtříd klasifikovaných podle určitých vlastností, které jsou pro každou z nich jedinečné. Klasifikace těchto enzymů se provádí přidáním písmen abecedy od A do Z za názvem enzymu.
Některé z podtříd nejlépe známých pro svou užitečnost jsou:
Jsou to dimery různých podjednotek. Rozpoznávají asymetrické sekvence a používají se jako ideální prekurzory pro generování řezných enzymů.
Jsou tvořeny jedním nebo více dimery a štěpí DNA na obou stranách rozpoznávací sekvence. Ořízněte obě vlákna DNA v intervalu párů bází před místem rozpoznávání.
Enzymy tohoto typu jsou polypeptidy s funkcí dělení a modifikace řetězců DNA. Tyto enzymy asymetricky rozřezávají obě vlákna.
Enzymy této podtřídy jsou nejpoužívanější v genetickém inženýrství. Mají katalytické místo a obecně vyžadují alosterický efektor. Tyto enzymy potřebují interagovat se dvěma kopiemi jejich rozpoznávací sekvence, aby provedly účinné štěpení. V této podtřídě jsou enzymy EcoRII a EcoRI.
Restrikční endonukleázy typu III jsou složeny pouze ze dvou podjednotek, jedna je zodpovědná za rozpoznávání a modifikaci DNA, zatímco druhá je odpovědná za štěpení sekvence.
Tyto enzymy vyžadují pro svou funkci dva kofaktory: ATP a hořčík. Restrikční enzymy tohoto typu mají dvě asymetrická rozpoznávací místa, translokují DNA způsobem závislým na ATP a rozřezávají ji mezi 20 až 30 bp sousedícími s rozpoznávacím místem..
Enzymy typu IV lze snadno identifikovat, protože štěpí DNA methylačními značkami a jsou tvořeny několika různými podjednotkami, které jsou zodpovědné za rozpoznávání a štěpení sekvence DNA. Tyto enzymy používají jako kofaktory GTP a dvojmocný hořčík.
Specifická místa štěpení zahrnují nukleotidová vlákna s methylovanými nebo hydroxymethylovanými cytosinovými zbytky na jednom nebo obou řetězcích nukleových kyselin..
Tato klasifikace seskupuje enzymy typu CRISPER-Cas, které identifikují a štěpí specifické sekvence DNA z napadajících organismů. Enzymy CAS používají syntetizovaný vodicí řetězec RNA od společnosti CRISPER k rozpoznávání a napadání napadajících organismů.
Enzymy klasifikované jako typ V jsou polypeptidy strukturované enzymy typu I, II a II. Mohou řezat části DNA téměř jakéhokoli organismu a se širokou délkou. Díky jejich flexibilitě a snadnému použití jsou tyto enzymy spolu s enzymy typu II jedním z nejpoužívanějších nástrojů současného genetického inženýrství..
K detekci polymorfismů DNA se používají restrikční enzymy, zejména v populačních genetických studiích a evolučních studiích využívajících mitochondriální DNA, aby se získaly informace o mírách substitucí nukleotidů..
V současné době mají vektory používané k transformaci bakterií pro různé účely multiklonovací místa, kde jsou rozpoznávací místa pro více restrikčních enzymů..
Mezi těmito enzymy jsou nejoblíbenější EcoRI, II, III, IV a V, získané a popsané poprvé od E-coli; HindIII, od H. influenzae a BamHI z B. amyloliquefaciens.
Zatím žádné komentáře