Löwenstein-Jensen střední základ, příprava a použití

3737
Egbert Haynes

The Löwenstein-Jensen médium je selektivní pevné médium pro izolaci a vývoj bakterií rodu Mycobacterium, jako je např Mycobacterium tuberculosis, M. avium, mimo jiné, s výjimkou druhů leprae, které nelze kultivovat.

Bakterie rodu Mycobacterium nerostou v běžných kultivačních médiích, proto bylo nutné navrhnout speciální médium pro jejich izolaci. Původní médium vytvořil Löwenstein a později ho upravil Jensen.

Löwenstein-Jensenovo médium s koloniemi Mycobacterium tuberculosis. Zdroj: Agarwal a kol. / BioMed Central Ltd., s laskavým svolením knihovny biologických obrázků

Úprava spočívala v eliminaci konžského červeného barviva a jeho nahrazení vyšší koncentrací malachitové zeleně. Také změnil koncentrace citrátu hořečnatého a fosforečnanu draselného.

Médium Löwenstein-Jensen v současné době obsahuje bramborový škrob, asparagin, citrát hořečnatý, fosforečnan draselný, síran hořečnatý, malachitovou zeleň, kyselinu nalidixovou, cykloheximid, linkomycin, rozbitá vejce, glycerin a vodu..

Mykobakterie se obvykle izolují z míst, která nejsou sterilní, jako je například sputum, moč, abscesy. To znamená, že většina vzorků bude obsahovat obvyklou mikrobiotu oblasti plus patogen..

Proto médium Löwenstein-Jensen obsahuje řadu inhibitorů ve svém složení, které představují malachitová zeleň, antibiotika a antimykotika..

Kromě toho musí být vzorky, které pocházejí z nesterilních míst, před nasazením na médium Löwenstein-Jensen dekontaminovány a neutralizovány..

Rejstřík článků

  • 1 Odůvodnění
  • 2 Příprava
  • 3 použití
    • 3,1 sputa
    • 3.2 Výplach žaludku, výplach průdušek a průduškový aspirát
    • 3.3 Moč
    • 3.4 Tekutina ascitu, pleurální tekutina, mozkomíšní mok
    • 3.5 Biopsie
    • 3.6 Výtěr z hrtanu
    • 3.7 Výsev
    • 3.8 Inkubace
  • 4 Kontrola kvality
  • 5 Omezení
  • 6 Reference

Základ

Přítomnost vajec a glycerinu v médiu Löwenstein-Jensen stimuluje růst mykobakterií, protože poskytují mastné kyseliny a proteiny nezbytné pro vývoj těchto mikroorganismů..

Médium Löwenstein-Jensen obsahuje malachitovou zeleň, která je inhibitorem doprovodné mikrobioty. Obsahuje však také kyselinu nalidixovou (35 µg / ml), která inhibuje gramnegativní mikroflóru, cykloheximid (400 µg / ml), který inhibuje saprofytické houby a kvasinky, a linkomycin (2 µ / ml), který inhibuje grampozitivní mikroflóru.

Některé komerční společnosti dávají přednost přidání následující kombinace antibiotik: polymyxin B 200 000 jednotek / l, amfotericin B 10 mg / l, karbenicilin 50 mg / l a trimethoprim 10 mg / l.

Toto médium neobsahuje agar, proto dochází ke ztuhnutí média v důsledku koagulace albuminu přítomného ve vejci během sterilizace..

Příprava

Naváží se 37,3 g dehydratovaného média v 600 ml destilované vody, do které bylo dříve přidáno 12 ml glycerolu. Směs se zahřívá a často se míchá, dokud se úplně nerozpustí. Autoklávujte médium při teplotě 121 ° C po dobu 15 minut.

Na druhé straně by měla být za aseptických podmínek připravena homogenní suspenze 1000 ml čerstvých vajec. Přidejte vaječnou suspenzi do 600 ml připraveného média při teplotě 50 - 60 ° C, vyhýbejte se vzduchovým bublinám.

Po autoklávování se přidávají také antibiotická řešení..

Nalijte médium do sterilních zkumavek se šroubovacím uzávěrem. Zkumavky zahřívejte na 85 ° C po dobu 45 minut v nakloněné poloze..

Barva připraveného média je akvamarínově zelená a může obsahovat bělavé skvrny v důsledku přítomnosti vaječných lipidů..

Hodnota pH média musí být 7,2 ± 0,2

Zkumavky skladujte až do použití v chladničce a chráněné před přímým světlem. Před setím temperujte.

Došlo k úpravě média s názvem „Gruftova modifikace Löwenstein Jensen“. Toto obsahuje stejné sloučeniny jako klasické médium, ale přidá se RNA-5mg / 100 ml a jako inhibitory obsahuje malachitová zeleň 0,025 g / 100 ml, penicilin 50 U / ml a kyselinu nalidixovou 35 ug / ml..

Aplikace

Médium Löwenstein-Jensen se používá k izolaci mykobakterií z různých typů vzorků. Ziehl-Neelsenovo barvení se doporučuje pro všechny vzorky, u nichž je podezření na přítomnost mykobakterií..

Některé vzorky pocházejí ze sterilních míst, jiné nikoli. Nesterilní vzorky musí být podle potřeby dekontaminovány:

Sputum

Vzorky sputa by měly být dekontaminovány následujícím způsobem: určete množství vzorku sputa v ml a přidejte do vzorku stejné množství 4% NaOH a inkubujte při 37 ° C.

Směs často třepejte po dobu 30 minut. Následně centrifugujte při 3000 ot / min po dobu 30 minut.

Zlikvidujte supernatant přes fenolický dezinfekční roztok. K setí použijte sediment, ale nejprve musí být pH neutralizováno.

K neutralizaci sedimentu, HdvaSW4 5% za přítomnosti indikátoru fenolové červeně, dokud nedosáhne neutrálního pH, které produkuje lososovou barvu.

Výplach žaludku, výplach průdušek a průdušek

V tomto případě musí být vzorek centrifugován při 3000 ot / min po dobu 30 minut. Supernatant se vyhodí a použije se peleta. Pro dekontaminaci sedimentu přidejte 3 ml 4% NaOH a míchejte často při 37 ° C po dobu půl hodiny..

Znovu centrifugujte, supernatant se vyhodí a použije se peleta. Ten musí být neutralizován, jak je vysvětleno ve vzorku sputa..

Moč

Nechte vzorek usadit v chladničce po dobu 24 hodin. Oddělte supernatant. Zbývající peleta by měla být centrifugována po dobu 30 minut při 3000 RMP. Supernatant znovu zlikvidujte a peletu rekonstituujte 3 ml sterilního fyziologického roztoku..

Přidejte 3 ml 4% NaOH a pokračujte v dekontaminaci a neutralizaci, jak je popsáno výše..

Tekutina ascitu, pleurální tekutina, mozkomíšní mok

V tomto typu vzorku je centrifugován a supernatant je odstraněn. Proveďte gram na sedimentu nebo pozorujte přímo pod mikroskopem; Pokud nejsou pozorovány žádné bakterie, není nutný ani dekontaminační krok, ani neutralizační.

V tomto případě lze vzorek zasít přímo pomocí sedimentu. Pokud existují bakterie, pokračujte v dekontaminaci a neutralizaci, jak je popsáno výše..

Biopsie

K tomuto typu vzorku je třeba přidat 5 ml destilované vody pro pozdější centrifugaci při 1500 ot / min po dobu 10 minut. Zlikvidujte supernatant a peletu znovu centrifugujte při 3500 ot / min po dobu 30 minut. Sediment použijte k zasetí kultivačního média.

Hrtanový výtěr

Tampon by měl být vložen do sterilní zkumavky obsahující stejné díly destilované vody a 4% NaOH. Tampón musí být přitlačen ke stěnám zkumavky, aby byl vzorek zředěn v kapalině. Odstřeďujte a použijte sediment. Neutralizujte sediment, jak již bylo popsáno.

Zaseto

Médium Löwenstein-Jensen se naočkuje přidáním 0,5 ml vzorku na povrch média. Otáčejte zkumavkou, aby se vzorek rozdělil do média. Nepoužívejte platinovou rukojeť.

Za účelem izolace lze naočkovat druhou zkumavku obsahující médium Stonebrink Mycobacterium bovis a další druhy, které nerostou v médiu Löwenstein-Jensen.

Inkubace

Naočkované zkumavky se inkubují aerobně při 37 ° C, víčko je mírně uvolněné a nakloněné přibližně 5 ° a chráněno před světlem. Prostředí lze obohatit o 5–10% oxidu uhličitého. Kultury kontrolujte dvakrát týdně, dokud se neobjeví kolonie.

Když byl vzorek absorbován, víčka jsou utažena. Maximální doba inkubace je 8 týdnů, pokud po této době nedojde k růstu, je hlášena jako negativní.

QA

Následující kmeny lze použít jako kontrolu kvality:

Mycobacterium tuberculosis ATCC 27294,  Mycobacterium kansasii ATCC 12478, Mycobacterium avium ATCC 19291, Mycobacterium bovis ATCC 19219, Mycobacterium fortuitum ATCC 6841, Escherichia coli ATCC 25922, Streptococcus pyogenes ATCC 19615, Cryptococcus neoformans ATCC 32045

Očekává se vynikající vývoj pro první tři zmíněné druhy, pro M. fortuitum růst musí být dobrý, zatímco pro M. bovis malý nebo žádný růst se neočekává. Zatímco jiné druhy než rod Mycobacterium musí být plně potlačeny.

Omezení

Připravené médium musí být chráněno před světlem. Dlouhodobé vystavení světlu způsobí, že se médium změní ze zelené na modrou, v tomto případě již médium nelze použít. Je to proto, že malachitová zeleň je fotocitlivá..

Médium, protože obsahuje vejce, může být snadno kontaminováno, pokud s ním není zacházeno asepticky. Může být rozpuštěn, pokud je kontaminován proteolytickými bakteriemi.

Pěstování a manipulace s bakteriemi rodu Mycobacterium vyžaduje kvalifikovaný personál, který je obeznámen s opatřeními biologické bezpečnosti, která je třeba dodržovat, aby nedošlo ke kontaminaci nebo kontaminaci ostatních..

HCl by se neměl používat v neutralizačním kroku kvůli tvorbě chloridu sodného, ​​který může být toxický pro Kochův bacil..

Vzorky by měly být uchovávány v chladu a chráněny před světlem, pokud nejsou zpracovávány..

Odkaz

  1. Laboratoře Francisco Soria Melguizo. 2009. Selektivní médium Löwenstein-Jensen. K dispozici na: f-soria.es
  2. Britannia Laboratories. 2017. Löwenstein-Jensen médium. K dispozici na: britanialab.com.
  3. Neogen Laboratories. Löwenstein-Jensen médium. K dispozici na adrese: foodsafety.neogen.com.
  4. „Löwenstein-Jensenovo médium.“ Wikipedia, The Free Encyclopedia. 20. listopadu 2018, 15:15 UTC. 24. dubna 2019, 18:34. wikipedia.org
  5. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiologická diagnostika. 5. vyd. Redakční Panamericana S.A. Argentina.
  6. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Bailey & Scott mikrobiologická diagnostika. 12 ed. Redakční Panamericana S.A. Argentina.
  7. Mac Faddin J. (2003). Biochemické testy pro identifikaci bakterií klinického významu. 3. vyd. Redakční Panamericana. Buenos Aires. Argentina.

Zatím žádné komentáře