Střední MIO základ, příprava a použití

1499
Anthony Golden

The napůl MIO je biochemický test používaný k identifikaci druhů bakterií patřících do čeledi Enterobacteriaceae. Je velmi výživný a skládá se z glukózy, kvasnicového extraktu, peptonu, tripteinu, hydrochloridu L-ornithinu, bromkrezolového purpuru a agaru.

Význam jeho zkratky (MIO) popisuje každý z parametrů, které lze v tomto médiu pozorovat; motilita, indol a ornithin. Motilita je schopnost mikroorganismu pohybovat se v důsledku přítomnosti bičíků. Aby bylo možné tuto vlastnost dodržet, musí být konzistence média polotuhá, takže přípravek obsahuje méně agaru..

Schéma interpretace výsledků na médiu MIO. Zdroj: Připravil autor MSc. Marielsa Gil

Produkce indolu ukazuje přítomnost enzymu tryptofanázy, který působí na aminokyselinu tryptofan, což vyžaduje použití detekčního činidla, aby byla výroba indolu viditelná..

Nakonec ornithin určuje, zda je bakterie schopna dekarboxylovat aminokyselinu, tj. Zda má enzym orinithin dekarboxylázu.

Rejstřík článků

  • 1 Odůvodnění
    • 1.1 Pepton, kvasnicový extrakt a triptein
    • 1.2 Pohyblivost
    • 1.3 Glukóza
    • 1,4 L-ornitin
    • 1,5 indikátor pH
  • 2 Technika setí a vývoje
  • 3 Příprava
    • 3.1 MIO médium
    • 3.2 Kovacsovo činidlo (vývojový test pro indol)
  • 4 Použijte
  • 5 Kontrola kvality
  • 6 Reference

Základ

Pepton, kvasnicový extrakt a triptein

Tyto prvky přispívají k nutriční síle tohoto média. Slouží jako zdroj živin a esenciálních aminokyselin pro vývoj bakterií.

Triptein je navíc zdrojem tryptofanu k prokázání přítomnosti enzymu tryptofanázy, který degraduje tryptofan redukční deaminací, uvolňuje indol, kyselinu pyrohroznovou, amoniak a energii..

Indol je bezbarvý, proto se jeho přítomnost projeví přidáním pěti kapek Ehrlichova nebo Kovacsova činidla, obě s p-dimethylaminobenzaldehydem..

Aldehydová skupina této sloučeniny reaguje s indolem a vytváří na povrchu agaru prstencový, fuchsiový červený produkt..

Jakákoli stopa barvy by měla být považována za pozitivní test. Důkaz by měl být přečten okamžitě, protože se časem barva zhoršuje.

Dále by měl být tento test odhalen poté, co byly zaznamenány výsledky motility a dekarboxylace ornithinu..

Výklad

Pozitivní test: tvorba fuchsiovo-červeného kruhu po přidání kapek Kovacsova činidla.

Negativní test: žádná tvorba prstenů.

Pohyblivost

Schopnost bakterií se pohybovat bude prokázána, pokud je pozorováno zakalené médium nebo je kolem počáteční inokulace rozšířena silná růstová linie..

Negativní test motility bude prokázán pozorováním tenké linie růstu a vše kolem něj bude bez růstu..

Je důležité, aby byla motilita přečtena před odhalením indolu, protože přidání činidla zakalí celé médium..

U mobilních, ale pomalu rostoucích bakterií je obtížné prokázat jejich pohyblivost tímto médiem. V tomto případě se doporučuje použít jiné testy nebo metody, jako je střední pohyblivost nebo metoda drop-pending..

Glukóza

Glukóza je fermentovatelný sacharid, který kromě dodávání energie okyseluje životní prostředí, což je nezbytná podmínka pro dekarboxylaci aminokyseliny ornithinu..

Kvašení glukózy musí vždy probíhat, počínaje zásadou, že všechny bakterie patřící do čeledi Enterobacteriaceae fermentují glukózu..

L-ornitin

V případě, že bakterie produkují enzym ornithin dekarboxylázu, může to působit, jakmile bylo médium okyseleno fermentací glukózy..

Enzym ornithin dekarboxyláza působí na karboxylovou skupinu aminokyseliny za vzniku aminu zvaného putresin, který znovu alkalizuje médium.

Tento test by měl být přečten po 24 hodinách inkubace, protože pokud se pokusíte číst dříve, než budete moci nesprávně interpretovat test falešně negativním.

Je třeba si uvědomit, že první reakcí, která nastane, je fermentace glukózy, a proto médium v ​​počáteční fázi (prvních 10 až 12 hodin) zežloutne. Pokud následně dojde k dekarboxylaci ornitinu, médium bude fialové.

Před odhalením indolu je důležité interpretovat dekarboxylační test na ornithinu, protože přidání Kovacsova činidla upravuje barvu média..

Výklad

Negativní test: žluté střední nebo žluté pozadí.

Pozitivní test: napůl úplně fialová.

Indikátor PH

V tomto případě se použije bromkrezolová fialová; ten, kdo má na starosti odhalení, když dojde ke změně pH v médiu. Po okyselení indikátor zezelená a po alkalizaci zčervená.

Technika setí a vývoje

K zasetí média MIO se použije přímá smyčka nebo jehla a s ní se odebere část kolonie, která má být studována..

Uprostřed MIO se provede přímá hluboká defekt. Nedoporučuje se provádět dvojitou punkci, protože může poskytnout falešný obraz pohyblivosti, pokud se punkce neprovádí na stejném místě.

Inkubujte 24 až 48 hodin při 37 ° C v aerobióze. Sledujte výsledky v tomto pořadí: motilitu, dekarboxylaci ornithinu a nakonec odhalte indol.

Doporučuje se asepticky odebrat 2 ml média, přenést jej do sterilní zkumavky a provést tam indolový test, takže pokud je negativní, může být zbytek původní zkumavky inkubován dalších 24 hodin, aby se odhalil znovu indol..

Vývoj indolu se provádí následujícím způsobem: Do média MIO se přidá 3 až 5 kapek Kovacsova činidla a směs se intenzivně protřepává. Pozoruje se, zda se objeví červený prsten fuchsie.

Příprava

Střední MIO

Naváží se 31 g média MIO a rozpustí se v litru destilované vody..

Zahřívejte, dokud se směs nevaří po dobu jedné minuty, často protřepávejte, dokud se agar úplně nerozpustí. Rozdělte 4 ml média do 13/100 zkumavek s bavlněnými čepičkami.

Sterilizujte v autoklávu při 121 ° C po dobu 15 minut. Vyjměte z autoklávu a nechte stát přímo ve stojanu tak, aby se vytvořil polotuhý blok.

Uchovávejte v chladničce 2-8 ° C. Před zasetím bakteriálního kmene nechte ohřát.

Barva dehydratovaného média je béžová a barva připraveného média mírně opaleskující fialová..

Konečné pH připraveného média je 6,5 ± 0,2

Médium při kyselém pH zožloutne a při alkalickém pH je fialové.

Kovacs Reagent (vývojář indolových testů)

Toto činidlo se připravuje následujícím způsobem:

Odměří se 150 ml amylového, izoamylového nebo butylalkoholu (kterýkoli ze tří). V něm se rozpustí 10 g p-dimethylaminobenzaldehydu. Potom se pomalu přidá 50 ml koncentrované kyseliny chlorovodíkové..

Připravené činidlo je bezbarvé nebo světle žluté. Mělo by být uchováváno v jantarové lahvičce a uchováváno v chladničce. Tmavě hnědá barva ukazuje jeho zhoršení.

Rovněž kovacsovo činidlo může být nahrazeno Ehrlichovým činidlem. Posledně jmenovaný, protože je citlivější, se dává přednost odhalení indolu v bakteriích, které jej produkují v nepatrném množství, například v některých nefermentujících gramnegatních tyčinkách a určitých anaerobech..

Použití

Toto médium je test, který doplňuje řadu biochemických testů pro identifikaci bakterií patřících do rodiny Enterobacteriaceae..

Data dekarboxylace ornithinu slouží k rozlišení mezi Shigella sonnei, který dává pozitivní, z Shigella boydii, Shigella flexneri a S. dysenterieae, které dávají negativy.

Rovněž odlišuje rod Klebsiella, který vykazuje negativní testy, od rodu Enterobacter, kde je většina jeho druhů pozitivní..

Zdroj: Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiologická diagnostika. 5. vyd. Redakční Panamericana S.A. Argentina.

QA

Pokaždé, když je připravena dávka média MIO, může být proveden kontrolní test. K tomu se používají známé nebo certifikované kmeny ke sledování chování média..

Kmeny, které lze použít, jsou Escherichia coli, Morganella morganii, Klebsiella pneumoniae, Enterobacter aerogenes Y Proteus mirabilis.

Očekávané výsledky jsou E. coli a M. morganii. Dan M: +, I: + a O: +.

Klebsiella pneumoniae dává všechny záporné (M: -, I: -, O :-). Proteus mirabilis Y Enterobacter aerogenes dát M: + I: - a O: +.

Reference

  1. Mac Faddin J. (2003). Biochemické testy pro identifikaci bakterií klinického významu. 3. vyd. Redakční Panamericana. Buenos Aires. Argentina.
  2. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Bailey & Scott mikrobiologická diagnostika. 12 ed. Redakční Panamericana S.A. Argentina.
  3. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiologická diagnostika. 5. vyd. Redakční Panamericana S.A. Argentina.
  4. Britannia Laboratories. MIO Medio 2015. Dostupné na: britanialab.com
  5. BD Laboratories. BBL Motility Indol Ornithine (MIO) Medium. 2007. Dostupné na: bd.com
  6. Valtek Laboratories. Střední M.I.O. Motilita, indol, ornitin. 2010. Dostupné na: andinamedica.com

Zatím žádné komentáře