Odůvodnění, postup a použití testu na koagulázu

2848
Egbert Haynes
Odůvodnění, postup a použití testu na koagulázu

The koagulázový test je to laboratorní technika používaná k odhalení přítomnosti koagulázového enzymu. Tento enzym má tu vlastnost, že koaguluje plazmu. Loeb v roce 1903 jako první popsal tento enzym.

Tento test se provádí na grampozitivních kokech, katalázách pozitivních, což umožňuje rozlišení kmenů Zlatý stafylokok ze zbytku stafylokoků, protože je to jediný mikroorganismus klinického významu, který jej produkuje.

Oba obrázky odhalují pozitivní test koagulázy. Zdroj: Levý obrázek: Philippinjl [CC BY-SA 3.0 (http://creativecommons.org/licenses/by-sa/3.0/)]. Pravý obrázek: Fotografie pořízená autorem MSc. Marielsa Gil.

V tomto smyslu jsou členové rodiny Staphylococaceae, kteří mají negativní test, často označováni jako koaguláza negativní Staphylococcus..

Existuje několik různých kmenů S. aureus  které mohou produkovat koagulázu, jako např Staphylococcus schleiferi spp coagulans, S. hyicus, S. intermedius a S. delphini.

První tři mají klinický význam na veterinární úrovni a lze je velmi zřídka najít jako původce infekcí u lidí, zatímco S. delphini nachází se pouze v mořském prostředí.

Kromě toho je lze snadno odlišit, protože S. hyicus Y S. intermedius nefermentujte mannitol a S. schleiferi spp coagulans nefermentuje maltózu ani trehalózu S. aureus fermentuje tyto sacharidy.

Přítomnost koagulázového enzymu byla spojena s virulencí kmenů. Tato teorie se však rozpadá s ohledem na skutečnost, že jsou pozorovány další virulentní druhy negativní na koagulázu schopné produkovat důležité infekce..

Rejstřík článků

  • 1 Odůvodnění
  • 2 Postup
    • 2.1 - Skluzový test na koagulázu
    • 2.2 - Zkouška koagulázou pomocí trubice
    • 2.3 - Koagulázový test s použitím fibrinogenu
  • 3 Použijte
  • 4 Kontrola kvality
  • 5 Omezení
  • 6 Reference

Základ

Zlatý stafylokok produkuje dva typy koagulázy, jeden, který zůstává připojen k buněčné stěně, nazývaný také aglutinační faktor nebo reaktivní koagulázový faktor (CRF), a extracelulární, která se uvolňuje v kapalných kulturách. Proto se jim říká vázaná koaguláza, respektive volná koaguláza..

Enzym koagulázy vděčí za svůj název akci, kterou produkuje. To má schopnost transformovat fibrinogen na fibrin a vytvářet zjevnou sraženinu, pokud se nachází v plazmě, to znamená, že tento enzym simuluje aktivitu trombinu v koagulační kaskádě.

Ve skutečnosti je jednou z nejuznávanějších teorií to, že vázaná koaguláza reaguje s volnou koagulázou, aby aktivovala faktory srážení. Tato aktivace generuje látku, která působí podobným způsobem jako protrombin, a vytváří sloučeninu s funkcí trombinu..

Rozdíl oproti normální koagulační kaskádě spočívá v tom, že tato reakce nevyžaduje přítomnost vápníku a není ovlivněna heparinem.

K provedení testu koagulázy stačí čelit čerstvé kultuře Staphylococcus s nejlépe králičí plazmou a pozorovat tak tvorbu sraženiny či nikoli.

Existují specifické techniky pro detekci navázané koagulázy a navázané a volné koagulázy současně..

Některé kmeny S. aureus dávají pozitivní výsledek rychleji než ostatní. Rychlost tvorby sraženiny je přímo úměrná koncentraci přítomné koagulázy..

Skluzový koagulázový test detekuje vázanou koagulázu a tubový test detekuje vázanou i volnou koagulázu.

Proces

-Zkouška koagulázou

Materiály

-Vyčistěte snímek

-Výhodně může být použita také králičí plazma, lidská nebo koňská plazma. Plazmu lze zakoupit komerčně lyofilizovanou a rekonstituovanou pro použití, nebo ji lze použít čerstvou (čerstvou). Další schůdnou alternativou je použití fibrinogenu.

-Sterilní fyziologický roztok (0,85%) (SSF).

Získání čerstvé plazmy

Odeberte venózní lidskou nebo zvířecí krev. Lze použít kterékoli z následujících antikoagulancií: EDTA, oxalát vápenatý, heparin nebo citrát sodný. Dobře promíchejte a odstřeďte. Asepticky odstraňte supernatant (plazmu) bez červených krvinek a vložte do sterilní zkumavky.

Plazmová separace. Zdroj: fotografie pořízená autorem: MSc. Marielsa Gil.

Lyofilizovaná plazma

Rekonstituujte podle pokynů na lahvičce s komerční soupravou.

Čerstvý fibrinogen

Pomocí citrátové plazmy promíchejte plazmu ve stejných částech s nasyceným roztokem chloridu sodného. Nechejte vysrážet a centrifugujte.

Zlikvidujte supernatant, sraženinu rekonstituujte až na 5násobek jejího objemu sterilní destilovanou vodou. Přidejte 5 jednotek heparinu na každý ml fibrinogenu. Uchovávejte ve sterilní zkumavce.

Technika

Kapka solného roztoku a kapka plazmy se umístí na sklíčko samostatně. Vezměte s platinovou smyčkou 1 nebo 2 čisté kolonie testovaného mikroorganismu.

Smíchejte bakteriální náplň v kapce plazmy a opakujte operaci s kapkou SSF. Výsledky okamžitě sledujte. Pozitivním výsledkem bude výsledek, u kterého je po jedné minutě na straně kapky s plazmou pozorována tvorba makroskopického aglutinátu (bílá sraženina).

Pokles SSF slouží jako negativní kontrola. Pokud je u SSF pozorována aglutinace, znamená to, že se mikroorganismus samoaglutinuje, což může vést k falešně pozitivním výsledkům. V tomto případě to musí být potvrzeno testem na trubici.

Doporučuje se také připojit pozitivní kontrolu se známým kmenem S. aureus.   

Výklad

Aglutinace během 5-20 sekund (silný pozitivní test).

Proměnlivá aglutinace mezi 20 sekundami a jednou minutou (zpožděný pozitivní test).

Určitý stupeň aglutinace po jedné minutě (pochybné důkazy). Doporučuje se zkoušku opakovat nebo potvrdit tubovou metodou.

Žádná aglutinace (negativní test).

Výsledek s SSF. Musí vždy dávat záporné, pokud dává kladné automaticky, výsledek testu je neplatný.

-Zkouška trubičkovou koagulázou

Materiály

-Sterilní zkumavka

-Plazma

-Vodní lázeň při 37 ° C.

Technika

Napipetujte 0,5 ml plazmy do zkumavky 12 x 75 se sterilní pipetou. Vložte platinovou smyčku 2 až 4 čistými koloniemi, abyste mohli studovat z pevné kultury po dobu 18 až 24 hodin, a opatrně ji rozpusťte v plazmě a promíchejte a inkubujte při 37 ° C po dobu 4 hodin.

Prohlédněte tubu během první hodiny, aniž byste ji protřepávali, jen ji jemně nakloňte. Pokud sraženina stále není vidět, lze ji pozorovat každých 30 minut, dokud nejsou dokončeny 4 hodiny. Pokud je po 4 hodinách stále záporný, může být ponechán až 24 hodin, ale při pokojové teplotě. Pozorujte a oznamte výsledek.

Na základě zkušeností někteří mikrobiologové doporučují k provedení testu použít 500 ul bakteriální suspenze z 18hodinové kultury v kapalném médiu..

Zdá se, že nabízí rychlejší a spolehlivější výsledky, než když emulguje kolonie z pevného média, zvláště pokud byla použita lidská plazma získaná z krevní banky..

Použití kmenů z bujónu pomáhá zředit možnou přítomnost lidských antistafylokokových protilátek v plazmě, které mohou inhibovat účinek koagulázy..

Výklad

Pokud je vidět sraženina, která zahrnuje veškerou tekutinu (úplné srážení) nebo sraženina bez zbytku tekutiny (částečné srážení), měla by být považována za pozitivní test..

Pokud se netvoří sraženina, to znamená, že suspenze zůstává homogenní, je test negativní.

-Koagulázový test s použitím fibrinogenu

Fibrinogen se používá stejně jako plazma a používá se jak pro sklíčka, tak pro zkumavky. Postupujte podle popisu pro plazmu a interpretujte stejným způsobem.

Použití

Používá se k rozlišení Zlatý stafylokok koaguláza negativních stafylokoků.

QA

Získejte čerstvé kultury kmene S. aureus být použit jako pozitivní kontrola. Kmen S. epidermidis jako negativní kontrola.

Omezení

-Pozitivní test by neměl být ponechán v inkubaci po dobu 24 hodin, protože S. aureus produkuje fibrinolysin, který sráží sraženinu.

-Pro spolehlivý test by měla být použita čerstvá nebo nově rekonstituovaná plazma, stejně jako je důležité použít čerstvé bakteriální kultury (18 až 24 hodin). Tím se zabrání falešným negativům.

-Zkouška musí být provedena ve spojení s negativní a pozitivní kontrolou.

-Některá pevná média mohou interferovat s testem koagulázy. Nedoporučuje se používat kolonie ze slaného mannitolového agaru.

-Pokud se používá citrátová plazma, doporučuje se umístit 5 jednotek heparinu na ml plazmy, aby se zabránilo falešným pozitivům. Je to proto, že některé mikroorganismy jiné než S. aureus mohou rozložit citrát a způsobit srážení plazmy. V tomto případě je vhodné udělat test gramatiky a katalázy..

-Při zkumavce je důležité sledovat reakci každých 30 minut, protože existují kmeny S. aureus Produkují vysoké koncentrace fibrinolysinu a rychle zředí nově vytvořenou sraženinu. Vyhněte se falešným negativům.

-Při monitorování testu se vyhněte prudkému protřepání zkumavky, mohlo by to zničit zahájení tvorby sraženiny, které se později neobnoví, a způsobit falešné negativy.

Reference

  1. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiologická diagnostika. 5. vyd. Redakční Panamericana S.A. Argentina.
  2. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Bailey & Scott mikrobiologická diagnostika. 12 ed. Redakční Panamericana S.A. Argentina.
  3. Mac Faddin J. (2003). Biochemické testy pro identifikaci bakterií klinického významu. 3. vyd. Redakční Panamericana. Buenos Aires. Argentina.
  4. Pro-Lab Laboratories. Králík koaguluje plazmu. K dispozici na: pro-lab.com
  5. „Koaguláza.“ Wikipedia, The Free Encyclopedia. 12. února 2019, 04:23 UTC. 22. dubna 2019, 15:50 wikipedia.org.

Zatím žádné komentáře