The barvení hematoxylin-eosin je barvicí technika, při které se používá kombinace hematoxylinových a eosinových barviv. Tato dvojice barviv je dokonalým duem, protože hematoxylin působí jako základní barvivo a eosin je kyselé barvivo..
Označení bazických nebo kyselých barviv neodkazuje na pH, které získají v roztoku, ale spíše hovoří o převládajícím podílu, pokud jde o aniontové nebo kationtové náboje, které mají, nebo o umístění chromoforové skupiny..
V tomto smyslu je hematoxylin považován za základní (kationtové) barvivo, a proto má afinitu ke kyselým strukturám, jako je jádro buněk. Zatímco eosin jako kyselé (aniontové) barvivo má afinitu k alkalickým nebo zásaditým strukturám, jako je buněčná cytoplazma.
Z tohoto důvodu je tato kombinace barviv široce používána pro barvení tkání, protože umožňuje jasně rozlišit jádra a cytoplazmy. Jádra skvrna tmavě modrá nebo fialová a cytoplazma růžová.
Barvení hematoxylin-eosinem je jednou z nejpoužívanějších barvicích technik v oblasti histologie a cytologie kvůli jeho snadné manipulaci a nízké ceně. Používá se k vizualizaci buněk, tlustých nervových vláken a přítomnosti určitých mikroorganismů ve tkáních, jako jsou: paraziti, houby a bakterie, mimo jiné.
Rejstřík článků
Hematoxylin je neutrální barvivo. Složka, která poskytuje barvu (chromofor), se však nachází v kationtovém nebo základním středu molekuly. Proto jeho afinita ke kyselým strukturám. Jeho chemický vzorec je C.16H14NEBO6 a jeho vědecký název 7,11b-dihydroindeno [2,1-C] chromen-3, 4,6a, 9,10 (6H) -pentol.
Barví hlavně jádra buněk, protože jsou velmi bohatá na nukleové kyseliny. Může také obarvit cytoplazmatické inkluze virového původu.
Aby se hematoxylin mohl zbarvit, musí být v oxidovaném stavu a vázán na kov. Ten bude sloužit k fixaci na tkáň, to znamená, že bude působit jako mořidlo.
Když se hematoxylin oxiduje, nazývá se to hematein. Oxidace se dosahuje vystavením činidla kyslíku (stárnutí) nebo látkami, které napomáhají jeho oxidaci (chemická oxidace).
Eosin je barvivo, které se zbarví červeně nebo růžově. Je nerozpustný ve vodě, i když existuje ve vodě rozpustná verze. Obecně se eosin připravuje rozpuštěním v alkoholu (95 ° ethanol).
Barví cytoplazmy, svalová vlákna, cytoplazmatické organely a kolagen, ale nezbarví buněčná jádra. Je to proto, že je záporně nabitý, proto má afinitu ke kladně nabitým strukturám..
Existují dva typy eosinu „Y“ a „B“. Eosin „Y“ je známý jako žlutý eosin. Jeho vědecký název je tetrabrom fl uorescein a jeho chemický vzorec je C.dvacetH8Br4NEBO5.
Na druhou stranu se eosin „B“ někdy označuje jako namodralý erytrosin B. Jeho vědecký název je dibromodinitro ores uorescein a vzorec je C.dvacetH8BrdvaNdvaNEBO9. Oba jsou si velmi podobné a rozdíl mezi používáním jednoho nebo druhého není opravdu patrný. Nejoblíbenější je však eosin „Y“.
Eosin má vlastnost rozlišovat mezi živou buňkou a mrtvou, protože je schopen pouze procházet membránou, aby zabarvil svou cytoplazmu, když jsou buňky mrtvé, a zanechá cytoplazmu buňky bezbarvou, pokud zůstane naživu.
S hematoxylin-eosinem lze obarvit a identifikovat silná nervová vlákna. Pro barvení tenkých nervových vláken to však není užitečné, protože k jejich vizualizaci je nutné barvení stříbrem..
Při barvení rohovité vrstvy kůže je barvivem, které působí, eosin, protože na této úrovni buňky nemají jádro.
V zrnité vrstvě kůže hematoxylin silně obarví keratohyalinové granule uvnitř buněk granulí. Naopak trnitá vrstva kůže je slabě obarvena hematoxylinem, zatímco bazální nebo zárodečná vrstva je dostatečně obarvena.
Eosin obarví cytoplazmu všech buněk a intenzita barvy se může u jednotlivých vrstev lišit..
Gómez et al., V roce 2005 prokázali, že barvení hematoxylin-eosinem bylo účinnější při identifikaci případů amébiázy způsobené Entamoeba histolytica Y Entamoeba dispar než nová metoda vizualizace (fyziologický roztok a lugol) u pacientů s akutním průjmovým onemocněním.
Rovněž se ukázalo, že je vysoce citlivý na detekci erytrofagocytózy (améby, které pohltily erytrocyty).
Walwyn a kol., V roce 2004 navrhli použití histologických skvrn k detekci mikroorganismů způsobujících infekci.
Pomocí barvení hematoxylin-eosinem byli schopni vizualizovat infekce způsobené Clostridium, Actinomyces, spirillae nebo Candida. Také se jim podařilo pozorovat přítomnost parazita Sarcoptes escabiei v kožních řezech a virových inkluzích cytomegalovirem a oparem v řezech různých tkání.
Barvení histologického řezu prochází řadou kroků. První věcí je získání histologické části. To musí být navoskováno, aby se později dosáhlo řezů (ultrajemných) pomocí mikrotomu. Technika se skládá z následujících kroků:
1-Odstranění přebytečného parafinu: k tomu můžete použít xylol nebo Heme-D, ponořte je na 3-5 minut.
2-Rehydratace vzorku: Toho je dosaženo ponořením vzorku do různých koncentrací alkoholů (ethanolu) v sestupném pořadí (100 °, 90 °, 70 °). Ve všech případech po dobu 7 minut.
3-Eliminace přebytečného alkoholu: za tímto účelem je ponořen do vody po dobu 7 minut.
4 barvení hematoxylinem: vzorek se ponoří na 6-10 minut do podnosu obsahujícího hematoxylin. Doba expozice závisí na velikosti a tloušťce vzorku..
5-Eliminace přebytečného hematoxylinu: Promývá se vodou po dobu 5 minut a poté se provede rychlý průchod (10-20 sekund) přes kyselý alkohol. Později se po dobu 5 minut znovu promyje vodou. Poté se ponoří do ethanolu při 96 ° C na 1 minutu.
6-barvení eosinem: za tímto účelem je vzorek ponořen na 5 minut do eosinové misky.
7-Dehydratace vzorku: za tímto účelem jsou podnosy s alkoholem (ethanolem) znovu vedeny, ale tentokrát ve vzestupném pořadí. (70 °, 90 °, 100 °). (Po dobu 5 sekund, 5 sekund, 1 minuta).
8 - Vyjasnění vzorku: za tímto účelem je vystaven xylolu po dobu 5-10 minut a sušen, aby se trvale uzavřel kanadským balzámem nebo jiným podobným materiálem.
Na stolici pacienta na sklíčku se provede stěr a fixuje se 80% alkoholem po dobu 5 minut. Plech se ponoří na 5 minut do hematoxylínu a okamžitě se promyje vodou..
Následně se rychle ponoří do kyselého alkoholu a poté do čpavkové vody. Promyje se vodou. Barví se 5 minut v eosinu. Vzorek je dehydratován, jak je vysvětleno v dosavadním stavu techniky, a nakonec je opláchnut xylenem.
V jednom litru destilované vody rozpusťte 50 gramů síranu hlinito-draselného nebo amonného. Po úplném rozpuštění přidejte 1 gram krystalizovaného hematoxylinu. Po úplném rozpuštění se přidá 1 g kyseliny citronové spolu s 50 g chloralhydrátu a 0,2 g jodičnanu sodného..
Směs se vaří 5 minut, poté se nechá vychladnout a filtruje se, aby se odstranily všechny pevné částice, které zde zůstaly. Takto připravené činidlo lze okamžitě použít.
Může být připraven na bázi alkoholu nebo na bázi vody.
Ve 100 ml ethanolu při 95 ° C se rozpustí 0,5 gramu eosinu „Y“. Poté přidejte několik kapek ledové kyseliny octové.
Ve 1250 ml destilované vody se rozpustí 25 gramů ve vodě rozpustného eosinu „Y“. Poté přidejte několik kapek ledové kyseliny octové.
Odměří se 0,5 ml koncentrované kyseliny chlorovodíkové a doplní se na 100 ml absolutním alkoholem.
Odměří se 0,5 ml koncentrovaného amoniaku a doplní se na 100 ml destilovanou vodou.
Zatím žádné komentáře