The Kinyounská skvrna je barvicí technika používaná k barvení kyselinovzdorných bakterií a parazitů. Vzniklo modifikací Ziehl-Neelsenova zabarvení; Obě techniky jsou interpretovány stejným způsobem, ale liší se ve dvou prvcích: při přípravě hlavního činidla a v tom, že metoda Kinyoun nepoužívá teplo.
Z tohoto důvodu je také známý jako studená skvrna Ziehl-Neelsen nebo Kinyoun. Je určen k barvení Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium leprae, atypické mykobakterie, Nocardias sp, Cryptosporidium parvum, Cryptosporidium meleagridis, Cryptosporidium felis, Cryptosporidium muris Y Cyclosporas cayetanensis.
Stojí za zmínku, že Nocardia skvrna slabě s touto technikou, protože jsou částečně odolné vůči kyselinám a alkoholu, takže pro tento rod existuje modifikace metodiky.
Studená technika Kinyoun byla zase kombinována s trichromovou technikou modifikovanou Didierem pro detekci kokcidií (Cryptosporidium parvum a Isospora belli) a výtrusy mikrosporidií (Enterocytozoon bieneusi Y Encephalitozoon intestinalis).
Rejstřík článků
Hlavním barvícím činidlem je karbolfuchsin nebo karbol fuchsin, který se váže na karbolové kyseliny existující ve voskové buněčné stěně bohaté na lipidy (kyseliny mykolové) mykobakterií a určitých parazitů..
Tato vazba není vyvážena kyselým bělidlem; proto jsou mikroorganismy definovány jako odolné vůči kyselinám a alkoholu.
Na rozdíl od Ziehl-Neelsenovy techniky - která fixuje barvivo teplem - není u Kinyounovy techniky tento krok nutný, protože roztok karbol fuchsinu připravený pro tuto techniku obsahuje vysokou koncentraci fenolu..
Fenol rozpouští lipidový materiál v buněčné stěně a umožňuje vstupu karbolfuchsinového barviva. Poté, co barvivo pronikne, zůstává fixováno navzdory promytí kyselým alkoholem.
Tímto způsobem kyselé rezistentní mikroorganismy získají charakteristickou červenou barvu, zatímco vše, co není kyselinovzdorným alkoholem, se zbarví a zafarbí modře..
- Modifikovaný carbol fuchsin.
- Alkohol-kyselina.
- Methylenová modř.
- Základní fuchsin: 4 gr.
- Fenol: 8 ml.
- Alkohol (95%): 20 ml.
- Destilovaná voda: 100 ml.
Základní fuchsin by měl být za stálého míchání pomalu rozpuštěn v alkoholu. Následně se krystalický fenol roztaví ve vodní lázni při 56 ° C. Po rozpuštění se přidá 8 ml k fuchsinovému roztoku připravenému výše.
- Koncentrovaná kyselina chlorovodíková: 3 ml.
- Ethanol (95%): 97 ml.
Musí se měřit, spojovat a míchat.
- Methylenová modř: 0,3 g.
- Destilovaná voda: 100 ml.
Zváží se a rozpustí se.
1 - Připravte nátěr přímo ze vzorku, kterým může být mimo jiné sputum, plicní tekutina, močový sediment, mozkomíšní mok nebo výkaly; nebo ze suspenze mikroorganismů získaných z čistých kolonií vyvinutých v primárním kultivačním médiu.
2 - Roztěr zafixujte teplem.
3- Umístěte nátěr na barvicí můstek a přikryjte připraveným činidlem Kinyoun carbol fuchsin. Nechte 3 nebo 5 minut odpočívat.
4- Umyjte destilovanou vodou.
5- Bělte kyselým alkoholem po dobu 3 minut a znovu promyjte destilovanou vodou.
6- Znovu odbarvujte kyselým alkoholem po dobu 1 nebo 2 minut, dokud již nedojde k dalšímu zbarvení.
7- Umyjte destilovanou vodou a nechte odtéct, sklíčko umístěte do svislé polohy.
8- Přípravek přikryjte methylenovou modří a nechte působit 4 minuty.
9 - Umyjte destilovanou vodou a nechte uschnout na vzduchu.
10- Prohlédněte si 40x a poté 100x.
Pokud chcete zlepšit a urychlit barvení kyselinovzdorných mikroorganismů, přidejte 1 kapku smáčedla (například Tergitol č. 7) do 30 nebo 40 ml přípravku Kinyoun Carbol Fuchsin.
Některé laboratoře mění kontrastní barvivo methylenové modři na jasně zelené nebo kyselinu pikrovou; první dává zelenou barvu pozadí a druhá generuje žlutou barvu.
Ke zlepšení barvení bakterií rodu Nocardia se používá modifikace barviva Kinyoun. Technika je následující:
1- Potřete nátěr Kinyoun carbol fuchsinem na 3 minuty.
2 - Umyjte destilovanou vodou.
3 - Krátce vybledněte kyselým alkoholem připraveným na 3%, dokud se již neprovádí barvení.
4- Znovu omyjte destilovanou vodou.
5- Přípravek přikryjte methylenovou modří a nechte působit 30 sekund.
6- Umyjte destilovanou vodou a nechte uschnout na vzduchu.
Tato technika se doporučuje pro analýzu vzorků stolice na kokcidie a spory Microsporidium sp ve stejnou dobu. Postup je následující:
1 - Roztěr přikryjte 10 minut Kinyoun carbol fuchsinem.
2- Odstraňte barvivo a omyjte destilovanou vodou.
3- Bělte po dobu 30 sekund alkoholem s kyselinou chlorovodíkovou.
4- Znovu omyjte destilovanou vodou.
5- Nátěr zakryjte trichromovým roztokem po dobu 30 minut při 37 ° C.
6- Umyjte destilovanou vodou.
7- Bělte po dobu 10 sekund alkoholem s kyselinou octovou.
8- Promyjte nátěr po dobu 30 sekund pomocí 95% ethanolu.
Jako pozitivní kontrola jsou nátěry připraveny s kmeny Mycobacterium tuberculosis a obarvte připravenými činidly, abyste ověřili, že bakterie mají správnou barvu (červená-fuchsie).
Negativní kontroly lze také použít k přípravě nátěrů s jakýmkoli kmenem, který není kyselinově rychlý, čímž se ověří, že celý vzorek přebírá kontrastní barvu..
Technika Kinyoun je jednodušší, protože eliminuje zahřívací krok, ale její hlavní výhodou je, že se dlouhodobě vyhýbá emisi par, vysoce toxických a rakovinotvorných. Proto je skvrna Kinyoun bezpečnější pro personál barvení..
Je důležité vzít v úvahu, že je třeba dbát na to, aby reagencie nepřicházely do přímého kontaktu s pokožkou, protože jsou korozivní a bělidlo je hořlavé..
Pokud jde o nevýhody, negativní nátěr nemusí nutně znamenat, že organismus není přítomen. Kromě toho může přítomnost buněčných úlomků vést k falešným pozitivům, což vede k nejasnostem v diagnostice..
Zatím žádné komentáře