Základ bramborového dextrózového agaru, příprava a použití

4414
Jonah Lester

The bramborový dextrózový agar Jedná se o pevné neselektivní výživné kultivační médium. Mohou v něm růst bakteriální a plísňové druhy, ale jeho použití je zvláště vhodné pro izolaci vláknitých hub a kvasinek. Je také známé jako médium PDA pro anglický výraz Potato Dextrose Agar.

Je zvláště užitečný pro izolaci fytopatogenních hub, tj. Těch, které působí na rostliny. K zasetí vzorků z infikované zeleniny lze použít i jiné prostředky, jako je Sabouraudův agar nebo malta-agar, avšak pro rutinní použití je výhodný bramborový dextrózový agar kvůli větší sporulaci..

Aspergillus niger a Sinemas na agaru s bramborovou dextrózou. Zdroj: Alextrevelian 006 na anglické Wikipedii [public domain] / Joselrojas [CC BY-SA 4.0 (https://creativecommons.org/licenses/by-sa/4.0)]

Používá se také k počítání plísňových kolonií ve vzorcích kosmetiky, farmaceutických výrobků a některých mléčných potravin. Stejně tak je vhodný k setí vzorků kožních škrábanců při hledání dermatofytů, které v tomto médiu rostou velmi dobře a vyvíjejí jejich charakteristické pigmenty..

Bramborové dextrózové médium je velmi jednoduché a snadno připravitelné médium v ​​laboratoři. Obsahuje, jak již název napovídá, nálev z brambor, dextrózy a agaru. Dále mohou být přidány inhibiční látky, aby se zabránilo růstu bakterií a zvýšila se selektivita pro druhy hub..

Rejstřík článků

  • 1 Odůvodnění
  • 2 Příprava
    • 2.1 - Domácí (nekomerční) příprava bramborového dextrózového agaru
    • 2.2 - Komerční příprava bramborového dextrózového agaru
  • 3 použití
    • 3.1 Postup setí rostlinných vzorků na agaru bramborové dextrózy
    • 3.2 Postup očkování vzorků kůže, vlasů nebo nehtů na bramborovém dextrózovém agaru
    • 3.3 Postup identifikace
    • 3.4 Počet kolonií
    • 3.5 Údržba kmenů hub
  • 4 Kontrola kvality
  • 5 Reference

Základ

Bramborový dextrózový agar je kultivační médium, které poskytuje výživné prvky nezbytné pro vývoj vláknitých hub a kvasinek..

Kombinace infuze brambor s glukózou poskytuje dokonalý zdroj energie pro uspokojivý růst hub. Zatímco agar je ten, kdo zajišťuje konzistenci média.

Médium samo o sobě neinhibuje růst bakterií, proto je neselektivním médiem. Aby byl selektivní, potřebuje přidání inhibičních látek, jako je kyselina vinná nebo antibiotika..

Příprava

-Domácí (nekomerční) příprava bramborového dextrózového agaru

Petriho misky

Je připraven následovně:

Na prvním místě jsou brambory velmi dobře umyty, čímž se odstraní půda, kterou mají. Jsou nakrájeny na tenké plátky se vším a skořápkou. 200 g brambor se zváží a vaří se v litru destilované vody po dobu půl hodiny.

Na konci času přefiltrujte nebo přeceďte veškerý přípravek přes tenkou látku.

Získaná kapalina se doplní destilovanou vodou do jednoho litru. Přidejte 20 g agar-agaru a 20 g dextrózy do infuze, dobře promíchejte a autoklávujte při 121 ° C za tlaku 15 liber po dobu 15 minut..

Nechejte vychladnout na 50 ° C a podávejte ve sterilních Petriho miskách. Připravené desky se skladují v chladničce..

Klíny

Mohou být také připraveny bramborové agarové klíny..

V tomto případě se před sterilizací v autoklávu vloží do zkumavek 12 až 15 ml média, později se autoklávuje a při opuštění leží na speciálních podpěrách, dokud neztuhne. Uchovávejte v lednici.

Médium zůstává na hodnotě pH 5,6 ± 0,2, avšak některé laboratoře přidávají 10% kyselinu vinnou ke snížení pH na 3,1 ± 0,1, aby se zabránilo růstu bakterií..

Ve stejném smyslu dávají jiné laboratoře přednost přidávání antibiotik, aby byla selektivní pro kultivaci hub a zabránila vývoji bakterií..

-Komerční příprava bramborového dextrózového agaru

Naváží se 39 g komerčně dostupného dehydratovaného média a rozpustí se v jednom litru destilované vody. Necháme 5 minut stát.

Směs se za častého míchání zahřívá, dokud se úplně nerozpustí. Následně se sterilizuje v autoklávu po dobu 15 minut při teplotě 121 ° C..

Lze připravit desky nebo klíny. Postupujte, jak je popsáno výše.

Hodnota pH je 5,6 ± 0,2. Pokud je požadováno pH 3,1, mělo by se před nanesením na misky přidat 14 ml sterilní 20% kyseliny vinné..

Surové médium je béžové a připravené médium je světle jantarové s mírně zakaleným nebo opaleskujícím vzhledem..

Aplikace

Způsob setí rostlinných vzorků na agaru bramborové dextrózy

-Pro skvrnité listy

Listy jsou nakrájeny na kousky.

Do sklenice o objemu 50 cm3 s 50% alkoholu vložte kousky listů (obarvené a zdravé kousky), abyste povrch dezinfikovali po dobu 20 až 30 sekund. Vyhoďte alkohol a přidejte 20% chlornanu sodného na 40 až 50 sekund, pokud jsou to tenké listy, a zvyšte čas na 80 sekund, pokud je to kůra a polena.

Chlórnan sodný zlikvidujte a dezinfikované kousky odeberte sterilními kleštěmi a umístěte je na povrch média (maximálně 10 kusů). Datum a inkubace při 20 - 30 ° C.

-Pro ovoce a hlízy

Pokud je ovoce masité, otevřete plody napadené plísní a odeberte kousky sterilním skalpelem, a to jak z nemocných, tak ze zdravých částí, a umístěte je na povrch agaru.

Pokud je ovoce citrusové, například citronové nebo pomerančové, musí být otevřeno a zaseta jeho semena.

Když je ovlivněn povrch ovoce a jsou pozorovány spory, ideální je použít metodu strouhání na talíři; Spočívá v tom, že se spór dotknete sterilizovanou a ochlazenou stěrkou ve tvaru „L“ a poté se na agaru dvakrát až třikrát naočkuje cikcak.

-Pro zrna

Jsou dezinfikovány podle popisu v listech a později umístěny na agar.

-Pro větve a stonky

Provede se škrábání kůry a později se odebere kousky zdravé a nemocné části a vyseje se přímo na agar.

Naočkované destičky se aerobně inkubují při teplotě 20 až 30 ° C po dobu 72 hodin.

Proces očkování vzorků kůže, vlasů nebo nehtů na agaru bramborové dextrózy

Odběr vzorků by měl být proveden pomocí čepele skalpelu č. 11, a to buď ke stříhání postižených vlasů, šupin nebo nehtů při hledání dermatofytů. Před odebráním vzorku musí být oblast dezinfikována 70% alkoholem..

-Vzorek kůže

U šupinatých lézí by měl být okraj léze seškrábán, protože houba se tam nachází pravděpodobněji.

U exsudativních lézí je vzorek odebrán suchým nebo mokrým tamponem. Okamžitě sejte na agar s bramborovou dextrózou nebo na agaru Sabouraud. Vyhýbejte se dopravním prostředkům.

Další metodou odběru vzorků je technika čtverců koberců Mariat a Adan Campos. V takovém případě je postižená oblast 5krát otřena kusem sterilní vlny pro pozdější kultivaci..

Vzorek lze umístit přímo do kultivačního média.

-Vzorek vlasů

V závislosti na patologii může být postižená část odříznuta nebo vykořeněna. Umístěte vzorek do kultivačního média.

-Vzorek na nehty

Specifická část postiženého nehtu může být poškrábána nebo řezána. Závisí to na typu poranění.

Před výsevem nakrájejte vzorek na 1 mm kousky, aby se zvýšila pravděpodobnost kontaktu houby s kultivačním médiem..

Postup identifikace

Kolonie získané na destičce se izolují ve zkumavkách obsahujících agar s bramborovou dextrózou, aby se provedlo makroskopické studium kolonií (vzhled, barva, konzistence, stupeň vývoje.

Mikroskopické studium (pozorování struktur a jejich útvarů) lze provádět mikrokulturami nebo přímým pozorováním pod mikroskopem mezi laminou a lamelou..

Počet kolonií

Toto médium lze také použít ke stanovení množství hub a kvasinek přítomných ve vzorcích rostlin, potravin, kosmetiky nebo léčiv. Za tímto účelem se používá bramborový dextrózový agar doplněný antibiotiky, například: (chloramfenikol, chlorotetracyklin nebo obojí).

Nalijte 1 ml vzorku - nejlépe zředěného - do sterilní a prázdné Petriho misky, poté roztavte zátku z bramborového dextrózového agaru a nechejte vychladnout na 45 ° C. Nalijte na Petriho misku a otáčejte do homogenizace. Necháme stát do tuhého stavu.

Inkubujte aerobně při teplotě 20-25 ° C (plísně) nebo 30-32 ° C (kvasinky) po dobu 5 až 7 dnů nebo déle, v závislosti na druhu hledané houby a typu vzorku. K inkubaci v obou teplotních rozsazích lze použít dvě destičky.

Počítání kolonií hub ve vzorku potravy. Bramborový dextrózový agar doplněný antibiotiky. Zdroj: Foto Pxhere.com / 777267

Údržba kmenů hub

Bramborový dextrózový agar lze použít k udržení životaschopných kmenů hub po několik let.

Za tímto účelem se houba pěstuje v klíncích agaru bramborové dextrózy a jakmile se houba rozroste, je pokryta minerálním olejem. Olej by měl být sterilizován v autoklávu po dobu 45 minut a měl by mít viskozitu přibližně 300 až 330 Saybolt. Olej by měl být 1 až 2 cm nad špičkou úkosu.

QA

Z každé připravené dávky by měly být odebrány 1 nebo 2 destičky a inkubovány při teplotě 25 ° C po dobu 48 hodin nebo při teplotě 20 ° C po dobu 96 hodin. Dobrá kontrola sterility je kontrola, při které není pozorován vývoj kolonií..

Známé nebo certifikované kontrolní kmeny, jako například:

Saccharomyces cerevisiae ATCC 9763, Candida albicans ATCC 10231, Aspergillus brasiliensis ATCC 16404, Trichophyton mentagrophytes ATCC 9533. Dobrý růst se očekává ve všech případech.

Reference

  1. Britannia Laboratories. Bramborový agar s glukózou. 2015. Dostupné na: britanialab.com
  2. Neogen Laboratories. Bramborový agar s dextrózou. K dispozici na adrese: foodsafety.neogen.com
  3. Laboratoř Insumolab. Bramborový dextrózový agar. Dostupné na: insumolab.cl
  4. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Bailey & Scott mikrobiologická diagnostika. 12 ed. Redakční Panamericana S.A. Argentina.
  5. Casas-Rincón G. Obecná mykologie. 1994. 2. vydání, Central University of Venezuela, Library Editions. Venezuela Caracas.
  6. Aceituno M. Hodnocení mikrobiologické kvality v očních stínech, kompaktní práškový typ národní výrobní laboratoře, podle referenční metody Pharmacopea Usp 2005. Práce splňující podmínky pro získání titulu Pharmaceutical Chemist. University of San Carlos of Guatemala.
  7. Cuétara M. Zpracování povrchových vzorků. Iberoamerický žurnál mykologie. 2007; str. 1-12

Zatím žádné komentáře