Funkce, typy a příklady endonukleáz

4318
David Holt

The endonukleázy jsou to enzymy, které štěpí fosfodiesterové vazby umístěné uvnitř nukleotidového řetězce. Endonukleázová restrikční místa jsou velmi různorodá. Některé z těchto enzymů štěpí DNA (deoxyribonukleová kyselina, náš genetický materiál) téměř kdekoli, to znamená, že jsou nespecifické.

Naproti tomu existuje další skupina endonukleáz, které jsou velmi specifické v oblasti nebo sekvenci, kterou mají štěpit. Tato skupina enzymů je známá jako restrikční enzymy a jsou velmi užitečné v molekulární biologii. V této skupině máme známé enzymy Bam HI, Eco RI a Alu I.

Endonukleázy interně štěpí DNA.
Zdroj: Dreamstime.com

Na rozdíl od endonukleáz existuje další typ katalytických proteinů - exonukleázy - které jsou zodpovědné za rozbití fosfodiesterových vazeb na konci řetězce.

Rejstřík článků

  • 1 Restrikční endonukleázy
  • 2 Funkce a aplikace restrikčních endonukleů
    • 2.1 Polymorfismus délky restrikčních fragmentů (RFLP)
  • 3 Typy restrikčních endonukleáz
    • 3.1 Typ I
    • 3.2 Typ II
    • 3.3 Typ III
    • 3.4 Typ IV
    • 3.5 Endonukleázy typu V
  • 4 příklady
  • 5 Reference

Restrikční endonukleázy

Restrikční endonukleázy nebo restrikční enzymy jsou katalytické proteiny, které jsou odpovědné za štěpení fosfodiesterových vazeb uvnitř řetězce DNA ve velmi specifických sekvencích.

Tyto enzymy lze zakoupit od několika biotechnologických společností a jejich použití je téměř nezbytné v rámci současných technik manipulace s DNA..

Restrikční endonukleázy jsou pojmenovány pomocí prvních písmen binomického vědeckého názvu organismu, ze kterého pocházejí, následovaného kmenem (je to volitelné) a končící skupinou restrikčních enzymů, ke kterým patří. Například Bam HI a Eco RI jsou široce používané endonukleázy..

Oblast DNA, kterou enzym rozpoznává, se nazývá restrikční místo a je pro každou endonukleázu jedinečná, i když několik enzymů se může na restrikčních místech shodovat. Toto místo obecně sestává z krátké palindromické sekvence o délce přibližně 4 až 6 párů bází, jako je AGCT (pro Alu I) a GAATTC pro Eco RI..

Palindromické sekvence jsou sekvence, které, i když jsou čteny ve směru 5 'až 3' nebo 3 'až 5', jsou identické. Například pro případ Eco RI je palindromická sekvence: GAATTC a CTTAAG.

Funkce a aplikace restrikčních endonukleů

Naštěstí pro molekulární biologové vyvinuli bakterie v průběhu evoluce řadu restrikčních endonukleáz, které interně fragmentují genetický materiál.

V přírodě se tyto enzymy vyvinuly - pravděpodobně - jako systém ochrany bakterií proti invazi cizích molekul DNA, jako jsou ty z fágů.

Za účelem rozlišení mezi nativním a cizím genetickým materiálem mohou tyto restrikční endonukleázy rozpoznávat specifické nukleotidové sekvence. DNA, která nemá tuto sekvenci, tedy může být nerušeně uvnitř bakterie..

Naproti tomu, když endonukleáza rozpozná restrikční místo, váže se na DNA a štěpí ji..

Biologové se zajímají o studium genetického materiálu živých věcí. DNA je však tvořena několika miliony bazických párů dlouhých. Tyto molekuly jsou extrémně dlouhé a musí být analyzovány v malých fragmentech..

K dosažení tohoto cíle jsou restrikční endonukleázy integrovány do různých protokolů molekulární biologie. Například lze zachytit a replikovat jednotlivý gen pro budoucí analýzu. Tento proces se nazývá „klonování“ genu..

Polymorfismus délky restrikčních fragmentů (RFLP)

Polymorfismy délky restrikčních fragmentů odkazují na vzor specifických nukleotidových sekvencí v DNA, které jsou restrikční endonukleázy schopné rozpoznat a rozřezat.

Díky specifičnosti enzymů je každý organismus charakterizován specifickým vzorem štěpení DNA, vznikající fragment různé délky.

Druhy restrikčních endonukleáz

Historicky byly restrikční endonukleázy klasifikovány do tří typů enzymů označených římskými číslicemi. V poslední době byl popsán čtvrtý typ endonukleázy.

Typ I.

Nejdůležitější charakteristikou endonukleáz typu I je to, že se jedná o proteiny tvořené několika podjednotkami. Každá z těchto funkcí funguje jako jediný proteinový komplex a obvykle má dvě podjednotky zvané R, dvě M a jednu S..

Část S je zodpovědná za rozpoznání restrikčního místa v DNA. R podjednotka je pro svou část nezbytná pro štěpení a M je zodpovědný za katalýzu methylační reakce..

Existují čtyři podkategorie enzymů typu I, známé pod písmeny A, B, C a D, které se běžně používají. Tato klasifikace je založena na genetické komplementaci.

Enzymy typu I byly prvními restrikčními endonukleázami, které byly objeveny a purifikovány. Nejužitečnější v molekulární biologii jsou však typu II, který bude popsán v následující části..

Typ II

Restrikční endonukleázy typu II rozpoznávají specifické sekvence DNA a štěpí se v konstantní poloze poblíž sekvence, která produkuje 5 'fosfáty a 3' hydroxyly. Obvykle vyžadují ionty hořčíku (Mgdva+), ale existují některé, které mají mnohem konkrétnější požadavky.

Strukturálně se mohou jevit jako monomery, dimery nebo dokonce tetramery. Rekombinantní technologie využívá endonukleázy typu II, a proto bylo charakterizováno více než 3 500 enzymů.

Typ III

Tyto enzymové systémy se skládají ze dvou genů, tzv mod Y hovězí, tento kód pro podjednotky, které rozpoznávají DNA, a pro modifikace nebo omezení. Obě města jsou nezbytná pro omezení, proces zcela závislý na hydrolýze ATP..

Za účelem štěpení molekuly DNA musí enzym interagovat se dvěma kopiemi nepalindromické rozpoznávací sekvence a místa musí být v substrátu v opačné orientaci. Štěpení předchází translokace DNA.

Typ IV

V poslední době byla identifikována další skupina. Systém se skládá ze dvou nebo více genů, které kódují proteiny, které štěpí pouze upravené sekvence DNA, buď methylovanou, hydroxymethylovanou nebo hydromethylovanou glukosyl.

Například enzym EckKMcrBC rozpoznává dva dinukleotidy obecné formy RmC; purin následovaný methylovaným cytosinem, který lze oddělit několika páry bází - od 40 do téměř 3000. Štěpení probíhá přibližně 30 párů bází za místem, které enzym rozpoznává.

Endonukleázy typu V

Endonukleázy tohoto typu jsou také známé jako endonukleázy "naváděcí“. Tyto enzymy rozpoznávají a štěpí cílovou sekvenci DNA na jedinečných místech v genomu od 14 do 40 bp.

Tyto enzymy jsou často kódovány v intronech a předpokládá se, že jejich funkcí je podpora horizontálního přenosu sekvence sekvence. Po rozřezání dojde k opravě rozpadu v dvojité šroubovici DNA na základě komplementární sekvence.

Příklady

Endonukleáza I z E-coli působí jako obranný systém proti fágům a parazitům. Nachází se hlavně mezi cytoplazmatickou membránou a buněčnou stěnou. Produkuje dvouvláknové zlomy v cizí DNA, s nimiž interaguje v periplazmatickém prostoru.

Endonukleázy CRISPR-Cas jsou enzymy, které působí na obranný mechanismus mnoha druhů bakterií. Ty identifikují a štěpí specifické sekvence DNA z napadajících organismů, které jsou obecně viry.

Nedávno vědci z Massachusetts Institute of Technology (MIT) objevili systém pro úpravu genomu CRISPR-Cas12bm s vysokou přesností pro modifikaci lidských buněk.

Reference

  1. Burrell, M. M. (ed.). (1993). Enzymy molekulární biologie. Totowa, NJ: Humana Press.
  2. Loenen, W. A., Dryden, D. T., Raleigh, E. A., & Wilson, G. G. (2013). Restrikční enzymy typu I a jejich příbuzní. Výzkum nukleových kyselin42(1), 20–44.
  3. Murray, P. R., Rosenthal, K. S., & Pfaller, M. A. (2017). Lékařská mikrobiologie + StudentConsult ve španělštině + StudentConsult. Elsevier Health Sciences.
  4. Nathans, D., & Smith, H. O. (1975). Restrikční endonukleázy v analýze a restrukturalizaci molekul DNA. Roční přehled biochemie44(1), 273-293.
  5. Pingoud, A., Fuxreiter, M., Pingoud, V., & Wende, W. (2005). Struktura a mechanismus restrikčních endonukleáz typu II. Buněčné a molekulární vědy o životě62(6), 685.

Zatím žádné komentáře

Co je exogamie?

Věda
2124
Sherman Hoover

Co je vědecké myšlení?

Věda
2438
Alexander Pearson

Sedm charakteristik nejdůležitějších kapalin

Věda
3884
Robert Johnston