Základy, příprava a použití testu Voges-Proskauer

907
Robert Johnston

The Voges-Proskauerův test je biochemický test používaný k identifikaci bakterií patřících do čeledi Enterobacteriaceae. To je zvláště užitečné pro rozlišení kmenů Escherichia coli z Klebsiella a Enterobacter, mimo jiné.

Test se provádí v kapalném kultivačním médiu zvaném Methyl Red-Voges Proskauer, známější pod zkratkou RM / VP. Toto médium se skládá z pufrovaného polypeptonu, glukózy, fosforečnanu draselného a destilované vody..

Methyl Red-Voges Proskauer (RM / VP) Komerční médium / VP Test pozitivní, respektive negativní. Zdroj: Fotografie pořízená autorem MSc. Marielsa Gil / Sudipta.nov15 [CC BY-SA 3.0 (https://creativecommons.org/licenses/by-sa/3.0)], z Wikimedia Commons

Současné médium RM / VP je modifikací média Clark a Lubs, které původně obsahovalo nižší koncentraci peptonů a glukózy. Proto bylo vyrobeno méně vodíkového iontu, potřebného pro pozitivní Voges-Proskauerovu reakci..

Test je založen na schopnosti mikroorganismu využívat glukózu cestou butylenglykolu a za přítomnosti kyslíku a alkalického pH vytvářet neutrální konečný produkt zvaný acetoin..

Na médiu RM / VP lze kromě odhalení testu Voges-Proskauer odhalit také methylovou červeň.

Rejstřík článků

  • 1 Odůvodnění
    • 1.1 Základ testu Voges-Proskauer
    • 1.2 Základ pro zpřístupnění důkazů a výklad
  • 2 Příprava
    • 2.1 Střední MR / VP
    • 2.2 Činidla Voges A
    • 2.3 Reagenční Voges B
  • 3 Zkušební postup Voges-Proskauer
    • 3.1 Vývoj zkoušky
  • 4 Použijte
  • 5 Kontrola kvality
  • 6 Reference

Základ

Testovací základna Voges-Proskauer

Pluripeptony přítomné v médiu poskytují základní nutriční požadavky pro růst bakterií. Glukóza je hlavní složkou. Mnoho bakterií má schopnost metabolizovat glukózu a tvořit kyselinu pyrohroznovou.

Kyselina pyrohroznová je středem v metabolismu glukózy a odtud může každý mikroorganismus postupovat různými cestami. Některé budou tvořit smíšené kyseliny, jako je kyselina mléčná, kyselina octová, kyselina mravenčí a kyselina jantarová, a jiné budou tvořit neutrální produkty, jako je 2,3-butandiol..

Voges-Proskauerův test odhalil schopnost mikroorganismu za aerobních podmínek tvořit acetylmethylkarbinol (acetoin), meziprodukt 2,3-butandiolu.

Acetoin je redukován a tvoří 2,3-butandiol, ale tato reakce je reverzibilní, takže pokud je oxidován 2,3-butandiol, vzniká acetoin. Proto je kyslík nezbytný.

Fosforečnan draselný je pufr, který pufruje směs na pH 6,9 ± 0,2.

Zveřejnění důkazů a základ pro výklad

K prokázání reakce je nutné provést vývoj pomocí dvou reagencií (Barritova reagencií), známých jako Voges A a Voges B.

Voges A je 5% roztok a-naftolu a Voges B je 40% přípravek hydroxidu draselného. Pokud není k dispozici hydroxid draselný, může být nahrazen 40% hydroxidem sodným.

Α-Naftol je katalyzátor, který zvýší intenzitu barvy reakce a zvýší citlivost testu. Nejprve se vždy musí přidat α-naftol a třepáním zkumavky tak, aby médium přišlo do styku s kyslíkem. Tímto způsobem se přítomný acetoin oxiduje na diacetyl a 2,3-butandiol se oxiduje na acetoin, který se předává diacetyl..

Tímto způsobem se α-naftol váže na diacetyl, který se zase připojil k jádru guanidinu přítomnému v aminokyselině arginin, druhý z pluripeptonů.

Hydroxid draselný nebo sodný je zodpovědný za absorpci COdva a reakce s peptony. Tato reakce způsobí vytvoření lososově růžové barvy, která je dobře viditelná po velmi dobrém protřepání zkumavky..

Správné množství diacetylu, peptonu a α-naftolu musí být smícháno, aby se barva okamžitě objevila. Pokud se tak nestane, nechá se trubice před tlumočením 15 minut odpočívat..

Obvykle je test pozitivní po 2 až 5 minutách, kdy je vidět slabě růžová barva. Pokud necháte 30 minut až 1 hodinu odpočívat, bude intenzita barvy maximální (intenzivní červená).

Negativní test se objeví, když se vývar změní na žlutý. Po 1 hodině, pokud je test negativní, se může v důsledku reakce hydroxidu draselného na α-naftol vytvořit měděné zbarvení.

Příprava

Střední MR / VP

Naváží se 17 g dehydratovaného kultivačního média a rozpustí se v litru destilované vody. Necháme 5 minut stát. Zahřejte do varu, aby se úplně rozpustil. Podávejte 3 až 4 ml ve zkumavkách a sterilizujte v autoklávu při teplotě 121 ° C po dobu 15 minut.

Dehydratované kultivační médium má béžovou barvu a připravené médium je světle jantarové barvy..

Konečné pH média je 6,9 ​​± 0,2.

Reagent Voges A

Naváží se 5 g α-naftolu a rozpustí se v 50 ml absolutního ethanolu. Poté pokračujte v přidávání ethylalkoholu, dokud nedosáhne 100 ml..

Činidlo Voges B.

Naváží se 40 g hydroxidu draselného a v kádince se rozpustí v 50 ml destilované vody. Pro regulaci teploty musí být sklo umístěno do lázně se studenou vodou, protože po rozpuštění přípravku teplota prudce stoupne.

Po vychladnutí roztoku se přenese do odměrné baňky a doplní se na 100 ml destilovanou vodou..

Zkušební postup Voges-Proskauer

Pro provedení testu Voges-Proskauer se RM / VP bujón naočkuje studovaným mikroorganismem z čisté kultury po dobu 18 až 24 hodin..

Inokulum by nemělo být příliš husté. Inkubuje se při 35-37 ° C po dobu 24 až 48 hodin, i když je někdy nutná inkubace několik dní. Cowan a Steel věří, že 5 dní je minimální inkubační doba nezbytná k detekci všech pozitivních druhů Voges-Proskauer (VP) z čeledi Enterobacteriaceae..

Vývoj testu

Oddělte alikvotní podíl 1 ml do zkumavky a vyvíjejte následujícím způsobem: Umístěte 12 kapek (0,6 ml) činidla Voges A a 4 kapky (0,2 ml) přípravku Voges B. Promíchejte, aby se provzdušnilo a před interpretací se nechalo usadit 5 - 10 minut. Pokud je však test stále negativní, nechte jej sedět a sledujte zkumavku po 30 minutách až 1 hodině..

Vzhled růžově červené barvy naznačuje, že reakce Voges-Proskauera je pozitivní. Pokud médium zůstane žluté, reakce je negativní.

Přidání vývojářů v uvedeném pořadí a množství je zásadní, aby se zabránilo falešným negativům..

Použití

Voges-Proskauerův test je užitečný k rozlišení mezi kmeny E-coli které jsou VP negativní, z rodů Klebsiella, Enterobacter, Serratia, mimo jiné, které jsou VP pozitivní.

Zdroj: Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiologická diagnostika. 5. vyd. Redakční Panamericana S.A. Argentina.

QA

Kontrolní kmeny lze použít k testování kvality připraveného média, včetně Escherichia coli ATCC 25922, Klebsiella pneumoniae ATCC 700603, Proteus mirabilis ATCC 43071, Salmonella typhimurium a Enterobacter cloacae ATCC 13047.

Očekávané výsledky jsou pozitivní reakce Voges-Proskauera pouze pro K. pneumoniae Y E. cloacae. Zbytek dává negativní reakce.

Reference

  1. Britannia Laboratories. MR-VP Medium. 2015. Dostupné na: www.britanialab.com
  2. Microkit Laboratories. M-Ident Voges Proskauer. 2014. Dostupné: http://www.medioscultivo.com
  3. Mac Faddin J. (2003). Biochemické testy pro identifikaci bakterií klinického významu. 3. vyd. Redakční Panamericana. Buenos Aires. Argentina.
  4. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Bailey & Scott mikrobiologická diagnostika. 12 ed. Redakční Panamericana S.A. Argentina.
  5. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiologická diagnostika. 5. vyd. Redakční Panamericana S.A. Argentina.

Zatím žádné komentáře