The Voges-Proskauerův test je biochemický test používaný k identifikaci bakterií patřících do čeledi Enterobacteriaceae. To je zvláště užitečné pro rozlišení kmenů Escherichia coli z Klebsiella a Enterobacter, mimo jiné.
Test se provádí v kapalném kultivačním médiu zvaném Methyl Red-Voges Proskauer, známější pod zkratkou RM / VP. Toto médium se skládá z pufrovaného polypeptonu, glukózy, fosforečnanu draselného a destilované vody..
Současné médium RM / VP je modifikací média Clark a Lubs, které původně obsahovalo nižší koncentraci peptonů a glukózy. Proto bylo vyrobeno méně vodíkového iontu, potřebného pro pozitivní Voges-Proskauerovu reakci..
Test je založen na schopnosti mikroorganismu využívat glukózu cestou butylenglykolu a za přítomnosti kyslíku a alkalického pH vytvářet neutrální konečný produkt zvaný acetoin..
Na médiu RM / VP lze kromě odhalení testu Voges-Proskauer odhalit také methylovou červeň.
Rejstřík článků
Pluripeptony přítomné v médiu poskytují základní nutriční požadavky pro růst bakterií. Glukóza je hlavní složkou. Mnoho bakterií má schopnost metabolizovat glukózu a tvořit kyselinu pyrohroznovou.
Kyselina pyrohroznová je středem v metabolismu glukózy a odtud může každý mikroorganismus postupovat různými cestami. Některé budou tvořit smíšené kyseliny, jako je kyselina mléčná, kyselina octová, kyselina mravenčí a kyselina jantarová, a jiné budou tvořit neutrální produkty, jako je 2,3-butandiol..
Voges-Proskauerův test odhalil schopnost mikroorganismu za aerobních podmínek tvořit acetylmethylkarbinol (acetoin), meziprodukt 2,3-butandiolu.
Acetoin je redukován a tvoří 2,3-butandiol, ale tato reakce je reverzibilní, takže pokud je oxidován 2,3-butandiol, vzniká acetoin. Proto je kyslík nezbytný.
Fosforečnan draselný je pufr, který pufruje směs na pH 6,9 ± 0,2.
K prokázání reakce je nutné provést vývoj pomocí dvou reagencií (Barritova reagencií), známých jako Voges A a Voges B.
Voges A je 5% roztok a-naftolu a Voges B je 40% přípravek hydroxidu draselného. Pokud není k dispozici hydroxid draselný, může být nahrazen 40% hydroxidem sodným.
Α-Naftol je katalyzátor, který zvýší intenzitu barvy reakce a zvýší citlivost testu. Nejprve se vždy musí přidat α-naftol a třepáním zkumavky tak, aby médium přišlo do styku s kyslíkem. Tímto způsobem se přítomný acetoin oxiduje na diacetyl a 2,3-butandiol se oxiduje na acetoin, který se předává diacetyl..
Tímto způsobem se α-naftol váže na diacetyl, který se zase připojil k jádru guanidinu přítomnému v aminokyselině arginin, druhý z pluripeptonů.
Hydroxid draselný nebo sodný je zodpovědný za absorpci COdva a reakce s peptony. Tato reakce způsobí vytvoření lososově růžové barvy, která je dobře viditelná po velmi dobrém protřepání zkumavky..
Správné množství diacetylu, peptonu a α-naftolu musí být smícháno, aby se barva okamžitě objevila. Pokud se tak nestane, nechá se trubice před tlumočením 15 minut odpočívat..
Obvykle je test pozitivní po 2 až 5 minutách, kdy je vidět slabě růžová barva. Pokud necháte 30 minut až 1 hodinu odpočívat, bude intenzita barvy maximální (intenzivní červená).
Negativní test se objeví, když se vývar změní na žlutý. Po 1 hodině, pokud je test negativní, se může v důsledku reakce hydroxidu draselného na α-naftol vytvořit měděné zbarvení.
Naváží se 17 g dehydratovaného kultivačního média a rozpustí se v litru destilované vody. Necháme 5 minut stát. Zahřejte do varu, aby se úplně rozpustil. Podávejte 3 až 4 ml ve zkumavkách a sterilizujte v autoklávu při teplotě 121 ° C po dobu 15 minut.
Dehydratované kultivační médium má béžovou barvu a připravené médium je světle jantarové barvy..
Konečné pH média je 6,9 ± 0,2.
Naváží se 5 g α-naftolu a rozpustí se v 50 ml absolutního ethanolu. Poté pokračujte v přidávání ethylalkoholu, dokud nedosáhne 100 ml..
Naváží se 40 g hydroxidu draselného a v kádince se rozpustí v 50 ml destilované vody. Pro regulaci teploty musí být sklo umístěno do lázně se studenou vodou, protože po rozpuštění přípravku teplota prudce stoupne.
Po vychladnutí roztoku se přenese do odměrné baňky a doplní se na 100 ml destilovanou vodou..
Pro provedení testu Voges-Proskauer se RM / VP bujón naočkuje studovaným mikroorganismem z čisté kultury po dobu 18 až 24 hodin..
Inokulum by nemělo být příliš husté. Inkubuje se při 35-37 ° C po dobu 24 až 48 hodin, i když je někdy nutná inkubace několik dní. Cowan a Steel věří, že 5 dní je minimální inkubační doba nezbytná k detekci všech pozitivních druhů Voges-Proskauer (VP) z čeledi Enterobacteriaceae..
Oddělte alikvotní podíl 1 ml do zkumavky a vyvíjejte následujícím způsobem: Umístěte 12 kapek (0,6 ml) činidla Voges A a 4 kapky (0,2 ml) přípravku Voges B. Promíchejte, aby se provzdušnilo a před interpretací se nechalo usadit 5 - 10 minut. Pokud je však test stále negativní, nechte jej sedět a sledujte zkumavku po 30 minutách až 1 hodině..
Vzhled růžově červené barvy naznačuje, že reakce Voges-Proskauera je pozitivní. Pokud médium zůstane žluté, reakce je negativní.
Přidání vývojářů v uvedeném pořadí a množství je zásadní, aby se zabránilo falešným negativům..
Voges-Proskauerův test je užitečný k rozlišení mezi kmeny E-coli které jsou VP negativní, z rodů Klebsiella, Enterobacter, Serratia, mimo jiné, které jsou VP pozitivní.
Kontrolní kmeny lze použít k testování kvality připraveného média, včetně Escherichia coli ATCC 25922, Klebsiella pneumoniae ATCC 700603, Proteus mirabilis ATCC 43071, Salmonella typhimurium a Enterobacter cloacae ATCC 13047.
Očekávané výsledky jsou pozitivní reakce Voges-Proskauera pouze pro K. pneumoniae Y E. cloacae. Zbytek dává negativní reakce.
Zatím žádné komentáře