The barvení spor Jedná se o metodiku používanou k barvení struktur rezistence, které tvoří některé bakteriální rody, když jsou v nepříznivých podmínkách; tyto struktury odpovídají formě přežití.
Existuje mnoho rodů, které tvoří spory; hlavními jsou však Bacillus a Clostridium. Tyto rody jsou považovány za relevantnější, protože mají druhy, které jsou pro člověka patogenní..
Každý bacil může způsobit vznik spór. V době barvení přípravku lze spor nalézt v bacilu (endospore) nebo mimo něj (exospore). U konvenčních barvicích technik pro bakterie - jako je Gramovo barvení - zůstávají spory bezbarvé.
V současné době existuje několik metod barvení, které jsou schopné proniknout silnou strukturou spór, aby je obarvily. Tyto metodiky jsou velmi rozmanité; Patří mezi ně Dornerova technika, Möellerova skvrna a metodologie Shaeffer-Fulton, známá také jako Wirtz-Conklin..
Ze všech zmíněných technik je v rutinních laboratořích nejběžněji používána metodologie Shaeffer-Fulton. Je pojmenována po dvou mikrobiologech, kteří vytvořili zbarvení v roce 1930: Alicii Shaeffer a MacDonald Fulton. Tato technika se však někdy nazývá Wirtz-Conklin na počest dvou bakteriologů z 20. let 20. století..
Rejstřík článků
Spory se neobarví běžnými skvrnami, protože mají velmi silnou stěnu. Složité složení spor brání vstupu většiny barviv.
Pokud je spora studována zvenčí dovnitř, jsou pozorovány následující vrstvy: první je exosporium, což je nejtenčí a vnější vrstva tvořená glykoproteiny.
Další je pokožka, která poskytuje odolnost vůči vysokým teplotám, následovaná kůrou složenou z peptidoglykanu. Později je stěna základny, která chrání protoplast.
Spora je dehydratovaná struktura, která obsahuje 15% vápníku a kyseliny dipikolinové. Z tohoto důvodu se většina technik barvení spor spoléhá na použití tepla, aby barvivo mohlo proniknout silnou strukturou..
Jakmile je spora obarvena, nemůže odstranit barvivo. V metodě Shaeffer-Fulton vstupuje malachitová zeleň do vegetativních buněk a při aplikaci tepla proniká také do endospory a exospór..
Promytím vodou se barvivo odstraní z vegetativní buňky. K tomu dochází, protože malachitové zelené barvivo je mírně zásadité, takže se slabě váže na vegetativní buňku..
Místo toho se nemůže dostat z spór a bacil je nakonec zbarven safraninem. Tento základ je platný pro ostatní techniky, ve kterých se děje něco podobného.
Chcete-li provést barvení spór, musíte mít čistou kulturu podezřelého kmene, který chcete studovat..
Kultura je vystavena extrémním teplotám po dobu 24 hodin, aby došlo ke stimulaci mikroorganismu k sporulaci. Za tímto účelem lze kulturu umístit do sušárny při teplotě 44 ° C nebo do chladničky (8 ° C) na 24 nebo 48 hodin..
Pokud zůstanou příliš dlouho při uvedených teplotách, budou pozorovány pouze exospory, protože všechny endospory již opustily bacil.
Po uplynutí této doby se na čisté podložní sklíčko vloží několik kapek sterilního fyziologického roztoku. Poté se odebere malá část kultury a vytvoří se jemné pomazánka.
Poté se nechá uschnout, nechá se zahřát a obarví se jednou z níže vysvětlených technik:
1- Připravte koncentrovanou suspenzi sporulovaného mikroorganismu v destilované vodě ve zkumavce a přidejte stejný objem filtrovaného Kinyoun carbol fuchsinu.
2 - Umístěte zkumavku na 5 až 10 minut do vroucí vodní lázně.
3 - Na čistém sklíčku smíchejte kapku předchozí suspenze s kapkou 10% vodného roztoku nigrosinu, povařte a přefiltrujte..
4 - Rozetřete a rychle osušte mírným teplem.
5 - Prozkoumejte 100x objektiv (ponoření).
Spory barví červeně a bakteriální buňky vypadají téměř bezbarvé na tmavě šedém pozadí.
1 - Suspenze sporulovaného mikroorganismu je rozprostřena na podložní sklíčko a fixována v horku.
2- Vzorek je pokryt páskem filtračního papíru, ke kterému je přidán karbolický fuchsin. Barvivo se zahřívá po dobu 5 až 7 minut plamenem Bunsenova hořáku, dokud nevznikne vývoj par. Poté je papír odstraněn.
3 - Přípravek se promyje vodou a poté vysuší absorpčním papírem.
4 - Roztěr zakryjte tenkým filmem 10% nigrosinu, pomocí druhého sklíčka naneste nigrosin nebo jehlu.
Zbarvení, které získávají spory a bakterie, je stejné jako barvení popsané v dosavadním stavu techniky.
1- Vytvořte jemný nátěr suspenzí sporulujícího mikroorganismu na podložním sklíčku a zafixujte jej zahřátím.
2- Zakryjte sklíčko 5% vodným roztokem malachitově zelené barvy (na sklíčko lze umístit filtrační papír).
3 - Zahřejte nad plamenem Bunsenova hořáku, aby se uvolnily páry a odstraňte plamen. Opakujte operaci po dobu 6 až 10 minut. Pokud se malachitový zelený roztok během postupu příliš odpařuje, více.
4- Vyjměte filtrační papír (pokud je nainstalován) a omyjte vodou.
5- Zakryjte sklíčko 0,5% vodným safraninem po dobu 30 sekund (některé varianty této techniky používají 0,1% vodný safranin a nechají ho 3 minuty).
S touto technikou se výtrusy jeví zelené a bacily červené..
Má tu nevýhodu, že endospory mladých kultur se dobře neobarví, protože vypadají extrémně čiré nebo bezbarvé. Aby se tomu zabránilo, doporučuje se použít kultury s 48 hodinovou inkubací..
1- Potřete nátěr chloroformem po dobu 2 minut.
2- Zlikvidujte chloroform.
3 - Zakryjte 5% kyselinou chromovou po dobu 5 minut.
4- Umyjte destilovanou vodou
5 - List je pokryt karbol fuchsin-fenikadou a vystaven plameni Bunsenova hořáku až do emise par; pak je na několik okamžiků odstraněn z plamene. Operace se opakuje, dokud není dokončeno 10 minut.
6- Umyjte vodou.
7- K odbarvení použijte okyselený ethanol (alkohol s kyselinou chlorovodíkovou). Nechte 20 nebo 30 sekund.
8- Umyjte destilovanou vodou.
9 - Kontrastinujte překrytím listu methylenovou modří po dobu 5 minut.
10- Umyjte destilovanou vodou.
11 - Nechte zaschnout a odeberte vzorek do mikroskopu.
Spory vypadají červeně a bacily modře. Je důležité nevdechovat páry, protože jsou toxické a z dlouhodobého hlediska mohou být karcinogenní..
V roce 2007 Hayama a jeho spolupracovníci vytvořili modifikaci Möellerovy techniky. Vyloučili krok zahřívání barviva a nahradili ho přidáním 2 kapek povrchově aktivní látky Tergitol 7 na každých 10 ml roztoku carbol fuchsin-carbol. Byly získány stejné výsledky.
Barvení spór poskytuje velmi cenné a užitečné informace pro identifikaci patogenu, protože jeho přítomnost, jeho tvar, umístění v bacilu a schopnost deformovat vegetativní buňku nebo ne, jsou údaje, které mohou vést druh zapojený do a. určitý žánr.
V této souvislosti stojí za to říci, že spory mohou být kulaté nebo oválné, mohou být umístěny ve středu nebo také v paracentrální, subminální nebo koncové poloze..
- Clostridium difficile tvoří oválnou sporu v koncové poloze, která deformuje bacil.
- Spora Clostridium terc je oválný, nedeformuje bacil a je umístěn na úrovni terminálu.
- Endospora z Clostridium tetani je terminální a deformuje bacil, což vyvolává vzhled paličky.
- Spory Clostridium botulinum, C. histolyticum, C. novy Y C. septicum jsou kulaté nebo oválné subterminální a deformují bacil.
- Endospora z Clostridium sordelli je umístěn ve střední poloze, s mírnou deformací.
Zatím žádné komentáře