Sabouraudův agarový základ, příprava a použití

3168
Basil Manning

The Sabouraudův agar, známý také jako agar s dextrózou Sabouraud, je to pevné kultivační médium, speciálně obohacené pro izolaci a vývoj hub, jako jsou kvasinky, plísně a dermatofyty..

Toto médium proto nemůže chybět v mikrobiologické laboratoři ke zkoumání přítomnosti patogenních nebo oportunních hub, ať už z klinických nebo neklinických vzorků. Rovněž je ideální pro růst vláknitých bakterií, jako jsou Streptomyces a Nocardias. Jeho použití je velmi široké, protože ho lze použít v lidské, zvířecí, rostlinné a průmyslové mykologii.

A. nenasazený Sabouraudův agar. B. Sabouraudův agar naočkovaný kvasinkami. Zdroj: Fotografie pořízené autorem MSc. Marielsa Gil

Toto médium bylo vytvořeno v roce 1896 významným dermatologem Raimondem Sabouraudem, který se stal světově uznávaným specialistou na poruchy pokožky hlavy, způsobené zejména dermatofyty..

Jeho vytvoření bylo tak důležité, že se od té doby používá a zůstává dodnes, i když s určitými úpravami.

I když je to pro houby speciální, mohou v tomto médiu růst bakterie, a proto je u vzorků se smíšenou flórou nutné zahrnout do jejich přípravy antibiotika, a tím potlačit růst přítomné bakteriální flóry..

Volba antibiotika musí být provedena pečlivě a s přihlédnutím k druhu houby, která má být získána, protože některá jsou inhibována v přítomnosti určitých látek.

Rejstřík článků

  • 1 Odůvodnění
    • 1.1 Nejpoužívanější kombinace agaru Sabouraud dextróza s antibiotiky
  • 2 Příprava
    • 2.1 Agar s dextrózou Sabouraud 
    • 2.2 Agar s dextrózou Sabouraud (modifikace Emmons)
    • 2.3 Agar s dextrózou Sabouraud (modifikace Emmons) s chloramfenikolem
    • 2.4 Sabouraud Emmons Dextrose Agar s cykloheximidem
    • 2.5 Sabouraudův dextrózový agar (Emmons) s chloramfenikolem a cykloheximidem
    • 2.6 Další antibiotika, která lze přidat
  • 3 Zvláštní úvahy
  • 4 Kontrola kvality
  • 5 použití
    • 5.1 Primární kultura
    • 5.2 Sporulace
    • 5.3 Zachování
    • 5.4 Mikrokultury
    • 5.5 V lidské mykologii
    • 5.6 Mykologie zvířat
    • 5.7 Environmentální mykologie
    • 5.8 Průmyslová mykologie
    • 5.9 Rostlinná mykologie
  • 6 Reference

Základ

Dextrózový agar Sabouraud je médium, které je ve své původní formulaci slabě selektivní díky svému kyselému pH 5,6 ± 0,2, nicméně bakterie se mohou stále vyvíjet, zejména při prodloužených inkubacích.

Médium obsahuje kaseinový pepton a pankreatické trávení živočišné tkáně, které poskytují zdroj uhlíku a dusíku pro růst mikroorganismů..

Obsahuje také vysokou koncentraci glukózy, která působí jako zdroj energie a podporuje růst hub nad bakteriemi. Vše smíchané s agar-agarem, složkou, která mu dodává správnou konzistenci..

Na druhou stranu může být agar s dextrózou Sabouraud selektivní, pokud jsou přidána antibiotika..

S antibiotiky je obzvláště užitečný ve vzorcích ran, otevřených vředů nebo v jakémkoli vzorku, u kterého existuje podezření na velkou bakteriální kontaminaci.

Nejčastěji používané kombinace agaru s dextrózou Sabouraud s antibiotiky

-Sabouraudův agar s chloramfenikolem: ideální pro regeneraci kvasinek a vláknitých hub.

-Sabouraudův agar s gentamicinem a chloramfenikolem: na tomto médiu rostou téměř všechny vláknité houby a kvasinky a inhibuje velké množství bakterií, včetně Enterobacteriaceae, Pseudomonas a Staphylococcus.

-Sabouraudův agar s cykloheximidem: je zvláště vhodný pro vzorky z kůže nebo dýchacích cest, pokud existuje podezření na dimorfní houby.

Cykloheximid by měl být používán s opatrností; Ačkoli se používá k inhibici růstu nepatogenních nebo environmentálních hub a kvasinek, které mohou být ve vzorku přítomny jako kontaminující látky, inhibuje také růst některých hub, jako jsou Cryptococcus neoformansAspergillus fumigatus, Allescheria boydii, Penicillium sp a jiné oportunní houby.

-Sabouraudův agar s chloramfenikolem a cykloheximidem: používá se především k izolaci dermatofytů a dimorfních hub. Má tu nevýhodu, že inhibuje některé druhy oportunistických hub, jako je Candida žádní albikáni, Aspergillus, Zygomycetes nebo C.. neoformané.

-Sabouraudův agar s chloramfenikolem, streptomycinem, penicilinem G a cykloheximidem: je ideální pro vzorky extrémně kontaminované bakteriemi a saprofytickými houbami, ale má tu nevýhodu, že inhibuje růst Actinomyces a Nocardias, kromě výše zmíněných oportunistických hub.

Příprava

Pokud máte přísady samostatně, lze je připravit následujícím způsobem:

Agar s dextrózou Sabouraud 

Vážit:

- 40 g dextrózy

- 10 g peptonu

- 15 g agaru-agaru

- Odměřte 1000 ml destilované vody

Všechny přísady se smísí, pH se upraví na 5,6. Rozpuštěné látky se rozpustí varem, 20 ml média se rozdělí do zkumavek o rozměrech 25 x 150 mm bez okraje a nejlépe s bavlněným víčkem..

Trubky s bavlněnou čepičkou. Zdroj: Fotografie pořízená autorem MSc. Marielsa Gil

V závislosti na dostupnosti lze použít i jiné velikosti tuby.

Jsou autoklávovány po dobu 10 minut v atmosféře tlaku (121 ° C). Doba autoklávování by neměla být překročena. Při opouštění autoklávu jsou trubice nakloněny pomocí podpěry, dokud neztuhnou ve špičce flétny..

Dalším způsobem je rozpuštění složek zahříváním až do varu. Ve stejné baňce autoklávujte 10 minut a poté rozdělte 20 ml do Petriho misek..

Pokud máte médium na agar s dextrózou Sabouraud, které již obsahuje všechny přísady, zvažte množství specifikované obchodní společností na jeden litr vody. Ostatní kroky jsou stejné jako výše popsané kroky.

Agar s dextrózou Sabouraud (modifikace Emmons)

Vážit:

-  20 g dextrózy

- 10 g peptonu

-  17 g agaru-agaru

-  Odměřte 1000 ml destilované vody

Všechny přísady se smísí, pH se upraví na 6,9. Postupujte stejným způsobem jako v předchozím případě.

Existují komerční domy, které nabízejí médium se všemi ingrediencemi. V takovém případě zvažte a připravte podle popisu na vložce..

Agar s dextrózou Sabouraud (modifikace Emmons) s chloramfenikolem

Zásobní roztok chloramfenikol

- Naváží se 500 mg chloramfenikolového základu

- Odměřte 100 ml 95% ethanolu

- Směs

Sabouraudovo dextrózové agarové médium (Emmons) se připraví, jak bylo popsáno výše, a navíc pro každý litr média se před autoklávováním přidá 10 ml zásobního roztoku chloramfenikol..

Sabouraud Emmons Dextrose Agar s cykloheximidem

Zásobní roztok cykloheximidu

- Naváží se 5 g cykloheximidu

- Odměří se 100 ml acetonu

- Směs

Sabouraudovo dextrózové agarové médium (Emmons) se připraví, jak bylo popsáno výše, a navíc pro každý litr média se přidá 10 ml zásobního roztoku cykloheximidu před autoklávováním..

Agar s dextrózou Sabouraud (Emmons) s chloramfenikolem a cykloheximidem

Sabouraudovo dextrózové agarové médium (Emmons) se připraví, jak již bylo popsáno, a navíc pro každý litr média se před autoklávováním přidá 10 ml zásobního roztoku chloramfenikolu a 10 ml zásobního roztoku cykloheximidu..

Další antibiotika, která lze přidat

20 000 až 60 000 jednotek penicilinu na litr média.

30 mg streptomycinu na litr média.

Obě musí být začleněny poté, co bylo médium autoklávováno, mírně ochlazeno (50-55 ° C).

0,04 g neomycinu na litr média.

0,04 g gentamicinu na litr média.

Zvláštní úvahy

Z bezpečnostních důvodů je vhodné zasít dextrózový agar Sabouraud do klínových trubek (nakloněných do zobáku) spíše než do Petriho misek, aby se zabránilo rozptýlení a vdechování spór..

Je důležité, aby zkumavky na agaru Sabouraud byly pokryty bavlnou a nikoli šroubovacím uzávěrem, protože se ukázalo, že semi-anaerobní podmínky inhibují tvorbu spor u některých kmenů, například Coccidioides immitis. Většina hub je také aerobní..

V případě použití šroubovacího uzávěru nezavírejte hermeticky.

QA

Připravené médium by mělo projít kontrolou kvality, aby se ověřilo jeho správné fungování. K tomu se vysévají určité kontrolní kmeny.

U agaru Sabouraud dextróza s chloramfenikolem kmeny ATCC o Candida albicans, který musí mít vynikající růst. Další destička je naočkována kmeny Escherichia coli, musí být zcela potlačeno.

Neinokulovaná destička se také inkubuje, ve které by neměly růst žádné mikroorganismy..

Pro Sabouraudův dextrózový agar s chloramfenikolem a cykloheximidem kmeny  Trichophyton mentagrophytes, by se měl vyvíjet dobře. Další destička je naočkována kmenem Aspergillus flavus, ve kterém musí být malý nebo žádný růst. Neočkovaná destička se navíc inkubuje, aby se prokázala její sterilita..

Pro Sabouraudův dextrózový agar s cykloheximidem kmeny Candida albicans, Trichophyton rubrum  nebo Microsporum canis, který musí vykazovat dobrý růst.

Podobně kmen Aspergillus flavus, vykazuje malý nebo žádný růst. Nakonec inkubujte neočkovanou destičku pro kontrolu sterility..

Aplikace

Primární kultura

Klasický agar s dextrózou Sabouraud obsahuje 4 gramy dextrózy a je vynikající jako primární izolační médium, protože vykazuje charakteristickou morfologii každé houby..

Je také vynikající pro demonstraci produkce pigmentu. Není to však nejvhodnější prostředek k pozorování sporulace..

Také se nedoporučuje pro pěstování Blastomyces dermatitidis, který je inhibován vysokou koncentrací přítomné glukózy.

Na druhou stranu je třeba při kultivaci vzít v úvahu určité úvahy.

Některé houby rostou nejlépe při pokojové teplotě, například plísně, jiné úspěšně rostou při teplotě 37 ° C, podobně jako některé kvasinky a jiné mohou růst při obou teplotách (dimorfní houby).

Z tohoto důvodu je někdy nutné použít několik Sabouraudových agarových destiček pro stejný vzorek, protože k inkubaci jedné destičky při pokojové teplotě a jiné při 37 ° C se často provádí duplicitní očkování..

Například, Sporothrix schenckii je zaseta do dvou talířů; jeden se inkubuje při teplotě místnosti, aby se získala fáze plísně a druhý se inkubuje při 37 ° C, aby se získala kvasinková fáze, ale v druhé je nutné přidat do média 5% krve.

V jiných případech, jako jsou vzorky mycetomu, se naočkují dvě agarové plotny Sabouraud, jedna s chloramfenikolem a druhá s cykloheximidem. První umožní růst původců mycetomu houbového původu (Eumycetoma) a druhý původců mycetomu bakteriálního původu, jako jsou aktinomycetomy..

Sporulace

Agar s dextrózou Sabouraud upravený Emmonsem obsahuje 2 gramy dextrózy a používá se nejen k izolaci, ale také k sporulaci a konzervaci hub.

V tomto médiu, pokud kmeny Blastomyces dermatitidis.

Zachování

Pro uchování kultur hub je lze skladovat v chladničce (2–8 ° C). Doba konzervace se může pohybovat mezi 2 až 8 týdny. Po uplynutí této doby musí být subkultivováni, aby proces zopakovali..

Některé houby se nejlépe udržují při pokojové teplotě, například Epidermophyton foccosum, Trichophyton schoenleinnii, T. violaceum Y Microsporum audounii.

Udržování kmene lze prodloužit, aby se zabránilo pleomorfismu, pokud je dextróza zcela odstraněna z agaru a pokud je množství agaru v médiu sníženo, aby se zabránilo suchu.

Mikrokultury

Pro identifikaci některých vláknitých hub je nutné provádět mikrokultury pomocí Sabouraudova agaru nebo jinými speciálními prostředky k pozorování struktur pohlavního a nepohlavního rozmnožování..

V lidské mykologii

Používá se hlavně pro diagnostiku plísňových onemocnění, zejména těch, která postihují kůži a její části (vlasy a nehty).

Vzorky mohou být sekrece, exsudáty, kůže, vlasy, nehty, sputum, mozkomíšní mok nebo moč. Běžně izolované patogeny jsou dermatofyty, houby, které způsobují subkutánní a systémové mykózy..

Mykologie zvířat

Zvířata jsou často napadena plísňovými infekcemi, proto je agar Sabouraud stejně užitečný v mykologii zvířat iu lidí..

Například dermatofyty mohou často působit na zvířata. To je případ Microsporum canis var distortum, Infikuje často psy, kočky, koně, prasata a opice. Rovněž, Microsporum gypseum infikuje psy, kočky a hospodářská zvířata.

Ptáci jako kuřata, kohouti a kuřata jsou postiženi Microsporum gallinae.

Jiné houby, jako např Zymonema farciminosum, Jsou také příčinou onemocnění zvířat, zejména koní, mezků a oslů, což způsobuje výrazný zánět lymfatických cév..

Sporothrix schenkii a Histoplasma capsulatum ovlivňovat domácí zvířata a lidi.

Environmentální mykologie

Mnoho patogenních nebo oportunistických hub se může kdykoli v daném prostředí soustředit, zejména na operačních sálech a jednotkách intenzivní péče (ICU) klinik a nemocnic. Proto je nutné je kontrolovat.

Dalšími zranitelnými místy jsou knihovny a staré budovy, které mohou být ovlivněny koncentrací environmentálních hub.

Ve studiích na životní prostředí se pro izolaci hub používá agar s dextrózou Sabouraud..

Průmyslová mykologie

Agar s dextrózou Sabouraud nemůže chybět pro studium kontaminujících hub při výrobě kosmetiky, potravin, nápojů, kůže, textilu, mimo jiné..

Rostlinná mykologie

Rostliny také trpí chorobami způsobenými houbami, které postihují různé části rostliny, což může dokonce ukončit sklizeň a způsobit velké ztráty v zemědělství..

Reference

  1. Cuenca M, Gadea I, Martín E, Pemán J, Pontón J, Rodríguez (2006). Mikrobiologická diagnostika mykóz a antifungální senzitivita. Doporučení Španělské společnosti infekčních nemocí a klinické mikrobiologie. Dostupné na: coesant-seimc.org
  2. Laboratoř ValteK. (2009). Agar s dextrózou Sabouraud s cykloheximidem. K dispozici na: andinamedica.com.
  3. Navarro O. (2013). Veterinární mykologie. Národní agrární univerzita. Nikaragua.
  4. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. 2009. Bailey & Scott Microbiological Diagnosis. 12 ed. Argentina. Redakční Panamericana S.A
  5. Casas-Rincón G. Obecná mykologie. 1994. 2. vydání, Central University of Venezuela, Library Editions. Venezuela Caracas.

Zatím žádné komentáře