Základ krevního agaru, použití a příprava

1365
Sherman Hoover

The krevní agar je to obohacené, diferenciální, ale neselektivní pevné kultivační médium. Používá se pro izolaci a růst nejrůznějších mikroorganismů z klinických vzorků nebo pro subkultury..

K očkování většiny klinických vzorků získaných v laboratoři by měl být zahrnut klasický krevní agar; s výjimkou vzorků stolice, kde to není užitečné, pokud nejsou připraveny s určitými úpravami.

Destička s krevním agarem

Toto kultivační médium je v zásadě tvořeno obohaceným základním agarem a 5% krve. Agarová báze se může lišit podle potřeb, ale bude se skládat hlavně z peptonů, aminokyselin, vitamínů, masového extraktu, chloridu sodného, ​​agaru a dalších..

Pokud jde o krev, obvykle se vyžaduje kontakt s viváriem, aby se získala krev ze zvířat, jako jsou ovce, králík nebo kůň. To však není vždy možné a někdy se používá lidská krev..

Médium pro krevní agar lze připravit v laboratoři nebo je lze zakoupit jako hotové od specializovaných společností. Příprava tohoto média je jednou z nejjemnějších, jakákoli neopatrnost při jeho přípravě bude mít za následek kontaminovanou dávku.

Proto musí být přijata veškerá možná opatření a nakonec musí být provedena kontrola kvality inkubace při 37 ° C 1 destička na každých 100 připravených.

Rejstřík článků

  • 1 Odůvodnění
  • 2 použití
    • 2.1 Volba krevní skupiny
    • 2.2 Volba typu základního agaru
    • 2.3 Použití krevního agaru podle základního média použitého k jeho přípravě
  • 3 Příprava
    • 3.1 Zvažte a rozpusťte
    • 3.2 Sterilizujte
    • 3.3 Krevní agregace
    • 3.4 Nalijte do Petriho misky
  • 4 Odkazy

Základ

Staphylococcus aureus kultivovaný na krevním agaru. Nathan Reading on Flickr Nathan R. on twitter [CC BY 2.0 (https://creativecommons.org/licenses/by/2.0)], via Wikimedia Commons
Již bylo zmíněno, že krevní agar má tu vlastnost, že je obohaceným, diferenciálním a neselektivním médiem. Níže je vysvětlen základ pro každou z těchto vlastností..

Krevní agar je obohacené médium, protože obsahuje 5–10% krve na agarové bázi jako hlavní přísadu. Obě sloučeniny obsahují mnoho živin a tato vlastnost v nich umožňuje růst většiny kultivovatelných bakterií..

K tomuto růstu dochází bez omezení; z tohoto důvodu je neselektivní. Pokud se však do tohoto média přidají sloučeniny, které zabraňují růstu některých mikroorganismů a upřednostňují růst jiných, stane se selektivní. To je případ, pokud jsou přidány určité typy antibiotik nebo antimykotik.

Podobně je krevní agar diferenciálním médiem, protože nám umožňuje rozlišit 3 typy bakterií: beta-hemolytické, alfa-hemolytické a gama-hemolytické..

Beta-hemolytika jsou ta, která mají schopnost úplně lyžovat nebo lámat červené krvinky a tvořit kolem kolonií čiré halo, proto produkují ß nebo ß-hemolýzu a mikroorganismy se nazývají ß-hemolytika..

Příklady ß-hemolytických bakterií jsou Streptococcus pyogenes Y Streptococcus agalactiae.

Alfa-hemolytika jsou ta, která provádějí částečnou hemolýzu, kdy se hemoglobin oxiduje na methemoglobin, čímž se kolem kolonií vytvoří nazelenalé zbarvení. Tento jev je známý jako α-hemolýza nebo α-hemolýza a bakterie jsou klasifikovány jako α-hemolytické..

Příklady a-hemolytických bakterií jsou Streptococcus pneumoniae Streptococcus skupiny viridany.

Konečně existují takzvané gama-hemolytické nebo nehemolytické bakterie. Ty rostou na agaru, aniž by na něm vytvářely změny, což je účinek známý jako γ-hemolýza a mikroorganismy jsou γ-hemolytické.

Příklad γ-hemolytických bakterií: některé kmeny skupiny D Streptococcus (Streptococcus bovis a Enterococcus faecalis).

Aplikace

Kultivační médium pro krevní agar je jedním z nejběžněji používaných v mikrobiologické laboratoři..

Mezi mikroorganismy schopné růst v médiu krevního agaru patří: přísné aerobní, fakultativní, mikroaerofilní, anaerobní, grampozitivní nebo gramnegativní bakterie, rychle rostoucí nebo pomalu rostoucí bakterie.

Rostou také některé nutričně náročné nebo náročné bakterie, stejně jako houby a kvasinky. Stejně tak je užitečné provádět subkultury nebo reaktivovat kmeny, které jsou metabolicky velmi slabé..

Volba krevní skupiny a základního agaru se však bude lišit v závislosti na pravděpodobném mikroorganismu podezřelém z regenerace a na použití, které bude použito na destičku (kultivace nebo antibiogram)..

Volba krevní skupiny

Krev může být jehněčí, králičí, kůň nebo člověk.

Nejvíce doporučovaná je jehněčí krev, až na některé výjimky. Například k izolaci druhů Haemophilus, kde je doporučená krev koňská nebo králičí krev, protože jehněčí krev má enzymy, které inhibují faktor V.

Nejméně doporučený je člověk, je však nejpoužívanější, možná proto, že je nejsnadnější jej získat. 

Krev musí být defibrinována, získána bez jakéhokoli typu přísady a ze zdravých zvířat. Pro použití lidské krve je třeba vzít v úvahu několik faktorů:

Pokud krev pochází od jedinců, kteří měli bakteriální infekce, budou mít specifické protilátky. Za těchto podmínek je pravděpodobné, že bude růst některých bakterií potlačen..

Pokud je získán z krevní banky, obsahuje citrát a určité bakterie nemusí v jeho přítomnosti růst. Na druhé straně, pokud krev pochází od pacientů užívajících antibiotika, může být růst vnímavých bakterií potlačen..

A pokud krev pochází od diabetika, přebytek glukózy narušuje správný vývoj hemolytických vzorců.

Volba typu základního agaru

Základní agar používaný k přípravě krevního agaru může být velmi široký. Mezi ně patří: výživný agar, agar s infuzí do mozkového srdce, sójový agar tryptikáza, agar Müeller Hinton, agar Thayer Martin, agar Columbia, agar Brucella, agar Campylobacter atd..

Použití krevního agaru podle základního média použitého k jeho přípravě

Živný agar

Tato základna je nejméně používaná, protože bude pěstovat hlavně nenáročné bakterie, jako jsou enterické bacily., Pseudomonas sp, S. aureus, Bacillus sp, mezi ostatními. Nedoporučuje se izolovat Streptococcus.

Agar s infuzí mozku do mozku (BHI)

Je to jeden z nejpoužívanějších základů krevního agaru, protože má nezbytné živiny pro růst většiny bakterií, včetně Streptococcus sp a další náročné bakterie. I když to není vhodné pro pozorování vzorců hemolýzy.

S touto bází se obvykle používá jehněčí krev.

Lze také připravit varianty krevního agaru, kde se přidají další sloučeniny k izolaci určitých mikroorganismů. K izolaci slouží například agar pro infuzi do mozku doplněný o králičí krev, cystin a glukózu Francisella tularensis.

Zatímco s cystin teluritem je to užitečné pro izolaci Corynebacterium diphteriae. Lze použít lidskou nebo jehněčí krev.

S první beta-hemolýzou bude považována za úzkou halo, zatímco u druhé bude halo mnohem širší.

Podobně se tato báze spolu s bacitracinem, kukuřičným škrobem, koňskou krví a dalšími obohacujícími doplňky (IsoVitaleX) používá k izolaci rodu Haemophilus sp ze vzorků dýchacích cest.

Pokud se navíc přidá kombinace antibiotik chloramfenikol - gentamicin nebo penicilin - streptomycin s koňskou krví, je ideální pro izolaci náročných patogenních hub, dokonce s vyšším výtěžkem než glukózový agar Sabouraud. To je zvláště užitečné při izolaci Histoplasma capsulatum.

Sójový agar Trypticase

Tato základna je nejvíce doporučována pro lepší pozorování hemolytického vzorce a pro provádění diagnostických testů, jako jsou taxony optoquinu a bacitracin. Je to klasický krevní agar, který se běžně používá.

S touto základnou můžete také připravit speciální krevní agar Corynebacterium diphteriae, s cystin teluritem Y jehněčí krev.

Podobně je kombinace tohoto agaru s jehněčí krví plus kanamycin-vankomycin ideální pro růst anaerobů, zejména Bacteroides sp.

Müeller Hintonův agar

Tato základna doplněná krví se používá k provádění antibiogramu náročných mikroorganismů, jako jsou např Streptococcus sp.

Je také užitečný pro izolaci bakterií, jako jsou Legionella pneumophila.

Thayer Martin Agar

Toto médium je ideální jako základna pro krevní agar, zejména při podezření na rod Neisseria Neisseria meningitidis, tak jako N. gonorrhoeae neroste na krevním agaru.

Používá se také k provádění testů citlivosti na Neisseria meningitidis.

Columbia agar

Tato základna je vynikající pro očkování vzorků žaludeční biopsie Helicobacter pylori.

Médium se připravuje přidáním 7% jehněčí krve defibrinované antibiotiky (vankomycin, trimethoprim, amfotericin B a cefsulodin), aby se omezil růst dalších druhů bakterií, které mohou být přítomny..

Stejná báze doplněná lidskou nebo jehněčí krví, kyselinou nalidixovou a kolistinem je užitečná pro izolaci Gardnerella vaginalis. Ideální také pro hodnocení antimikrobiální citlivosti na antibiotika stejného mikroorganismu.

Kromě toho se používá k přípravě krevního agaru pro kultivaci anaerobů s přídavkem aminoglykosidů a vankomycinu..

Tato základna vám umožňuje správně sledovat hemolytické vzorce.

Brucella agar

Toto médium používané jako základ pro krevní agar spolu s přídavkem vitaminu K je ideální pro kultivaci anaerobních bakterií. V tomto případě se doporučuje použít jehněčí krev..

Campylobacter agar

Campylobacter agar doplněný 5% ovčí krve a 5 antibiotiky (cefalothin, amfotericin B, trimethoprim, polymyxin B a vankomycin), je médium používané k izolaci Campylobacter jejuni ve vzorcích stolice.

Příprava

Každý obchodní dům přináší pokyny k přípravě litru kultivačního média na zadní straně nádoby. Odpovídající výpočty lze provést za účelem přípravy požadovaného množství v závislosti na vybraném základním agaru.

Zvažte a rozpusťte

Základní agar je dehydratován (prášek), proto musí být rozpuštěn v destilované vodě upravené na pH 7,3.

Množství indikované zvoleným základním agarem se zváží a rozpustí v odpovídajícím množství vody v baňce, poté se zahřeje na mírném ohni a míchá se rotačními pohyby, dokud se nerozpustí veškerý prášek..

Sterilizovat

Po rozpuštění sterilizujte v autoklávu po dobu 20 minut při teplotě 121 ° C.

Krevní agregát

Při opuštění autoklávu se baňka nechá vychladnout, dokud teplota neosciluje mezi 40 až 50 ° C; Je to teplota, kterou podporuje lidská pokožka a zároveň agar ještě neztuhl.

K tomu se baňky dotkne rukou a je-li teplo snesitelné, je ideální teplota přidat odpovídající množství defibrinované krve (50 ml na každý litr agaru). Jemně promíchejte pro homogenizaci.

Průchod agregace krve je zásadní, protože pokud se provádí, když je médium velmi horké, červené krvinky se rozpadnou a médium nebude sloužit k pozorování hemolýzy.

Pokud je přidán příliš studený, vytvoří se hrudky a povrch média nebude hladký, aby bylo možné řádné skórování..

Nalijte do Petriho misky

Podávejte ve sterilních Petriho miskách ihned po homogenizaci krve. Do každé Petriho misky se nalije přibližně 20 ml. Tento postup se provádí v digestoři s laminárním prouděním nebo v blízkosti hořáku.

Při podávání krevního agaru v Petriho miskách by na povrchu misky neměly zůstat žádné vzduchové bubliny. Pokud k tomu dojde, plamen Bunsenova hořáku rychle prochází přes desku, aby je odstranil..

Destičky se nechají ztuhnout a skladují se v chladničce (2-8 ° C) převrácené až do použití. Před použitím destiček s krevním agarem je nutné je temperovat (nechat dosáhnout pokojové teploty), aby bylo možné je vysít..

Připravené talíře trvají přibližně 1 týden.

Reference

  1. Bayona M. Mikrobiologické podmínky pro pěstování Helicobacter pylori. Rev Col Gastroenterol 2013; 28 (2): 94-99
  2. García P, Paredes F, Fernández del Barrio M. (1994). Praktická klinická mikrobiologie. University of Cadiz, 2. vydání. Publikační služba UCA.
  3. „Krevní agar.“ Wikipedia, The Free Encyclopedia. 10. prosince 2018, 14:55 UTC. 27. prosince 2018, 01:49 en.wikipedia.org.
  4. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Bailey & Scott mikrobiologická diagnostika. 12 ed. Argentina. Redakční Panamericana S.A.
  5. Laboratorní veterinární diagnostické centrum CEDIVET. Guatemala. Dostupné na: trensa.com.
  6.  Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiologická diagnostika. (5. vydání). Argentina, Editorial Panamericana S.A.

Zatím žádné komentáře