The DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenylindol) Jedná se o barvivo, které díky své fluorescenční vlastnosti slouží jako marker a je mimo jiné široce používáno v technice fluorescenční mikroskopie nebo průtokové cytometrie. Fluorescence, kterou vydává, je jasně modrá, k její excitaci dochází mezi 455-461 nm (UV světlo).
DAPI barvivo může procházet buněčnou membránou mrtvých buněk s velkou lehkostí. Může také obarvit jádra živých buněk, ale v tomto případě musí být jeho koncentrace vyšší.
Barvivo je schopné přistupovat k buněčné DNA, pro kterou má speciální afinitu, váže se s velkou aviditou na dusíkaté báze adenin a thymin. Z tohoto důvodu je to velmi užitečné v některých technikách molekulární biologie..
Tato sloučenina patří do skupiny indolových barviv a bylo prokázáno, že má větší citlivost na DNA než ethidiumbromid a propidiumjodid, zejména na agarózových gelech..
Použití tohoto fluorescenčního barviva je velmi široké, protože je užitečné pro: studium změn v DNA v apoptotických procesech (buněčná smrt), a tedy detekce buněk v tomto procesu; pro DNA fotoprotisk (DNA foto tisk); studovat bakteriální kontaminaci; nebo k vizualizaci jaderné segmentace.
Rovněž se používá při studiu chromozomálních pásem při detekci DNA z Mycoplasmas sp, v interakci DNA-protein, v barvení a počítání buněk imunofluorescencí a dokonce k barvení zralých pylových zrn.
Rejstřík článků
DAPI je zkratka pro svůj chemický název (4 ', 6-diamidino-2-fenylindol). Jeho molekulární vzorec je C16HpatnáctN5. Má molekulovou hmotnost 350,3. V blízkosti rozsahu UV záření (345 až 358 nm) dochází k maximální excitaci komplexu DAPI-DNA, zatímco k maximální emisi fluorescence dochází mezi 455-461 nm..
Toto barvivo se vyznačuje tím, že je to žlutý prášek, ale struktury označené tímto fluoroforem vyzařují jasně modré světlo..
Jedná se o sloučeninu rozpustnou ve vodě, pro urychlení jejího rozpuštění však může být aplikováno určité teplo. Může být naředěn PBS, ale ne přímo rozpuštěn v něm..
Jakmile je barvivo připraveno, musí být skladováno ve tmě, tj. Chráněno před světlem, při teplotě 2 až 8 ° C (v chladničce). Za těchto podmínek je barvivo stabilní déle než 3 týdny nebo měsíce..
Pokud je chráněn před světlem, ale ponechán při pokojové teplotě, jeho stabilita klesá na 2 nebo 3 týdny, ale při vystavení přímému světlu je zhoršení velmi rychlé. Pokud chcete skladovat mnohem déle, můžete jej ochladit na -20 ° C v alikvotních částech.
Toto barvení je založeno na generování jaderného kontrastního barviva v hlavních technikách molekulární biologie, jako jsou: průtoková cytometrie, fluorescenční mikroskopie a barvení metafázových chromozomů nebo mezifázových jader, mimo jiné..
Tato technika je založena na velké afinitě, kterou má barvivo k dusíkatým bázím (adenin a thymin) obsaženým v genetickém materiálu (DNA) ve vedlejší drážce. Zatímco na cytoplazmatické úrovni nezanechává velmi malé pozadí.
Když se fluorescenční barvivo váže na adeninové a tyminové oblasti DNA, fluorescence se významně zvyšuje (20krát více). Barva, kterou vydává, je jasně modrá. Je pozoruhodné, že při vazbě na páry bází GC (guanin-cytosin) nedochází k žádné emisi fluorescence.
Je důležité si uvědomit, že ačkoli má také afinitu k RNA, nezpůsobuje to problém, protože nejvyšší stupeň emise energie z této molekuly se vyskytuje na jiné vlnové délce (500 nm), na rozdíl od DNA, která tak činí při 460 nm . Zvýšení fluorescence po navázání na RNA je navíc pouze 20%..
DAPI se používá více k barvení mrtvých (fixovaných) buněk než živých buněk, protože k barvení těchto barviv je zapotřebí mnohem vyšší koncentrace, je to proto, že buněčná membrána je mnohem méně propustná pro DAPI, když je naživu.
Barvu DAPI lze použít v kombinaci s červenými a zelenými fluorofory pro vícebarevný zážitek.
DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenylindol) je vynikající fluorofor, a proto se široce používá v různých technikách a pro různé účely. Níže je vysvětleno použití DAPI v hlavních technikách.
Vědci Gohde, Schumann a Zante v roce 1978 jako první použili a navrhli DAPI jako fluorofor v technice průtokové cytometrie, což mělo velký úspěch díky vysoké citlivosti na DNA a vysoké intenzitě fluorescenční emise..
Použití DAPI v této technice umožňuje studium buněčného cyklu, kvantifikaci buněk a barvení živých a mrtvých buněk..
Ačkoli existují další barviva, jako je ethidiumbromid, oxid Hoechst, akridinová oranžová a propidiumjodid, DAPI je jedním z nejpoužívanějších, protože je fotostabilnější než dříve zmíněné..
U této techniky je nutné buňky fixovat, k tomu lze použít absolutní ethanol nebo 4% paraformaldehyd. Vzorek se centrifuguje a supernatant se vyhodí, následně se buňky hydratují přidáním 5 ml PBS pufru po dobu 15 minut..
Po uplynutí této doby připravte barvení DAPI barvicím pufrem (FOXP3 od BioLegend) v koncentraci 3 µM.
Vzorek centrifugujte, supernatant vyhoďte a poté přikryjte 1 ml roztoku DAPI po dobu 15 minut při pokojové teplotě..
Odeberte vzorek do průtokového cytometru příslušným laserem.
Další technikou, ve které se používá DAPI, je průtoková mikrofluorometrie spolu s dalším fluoroforem zvaným mithramycin. Oba jsou užitečné pro individuální kvantifikaci DNA chloroplastů, ale DAPI je nejvhodnější pro měření bakteriofágových částic T4..
Tato technika v zásadě používá sondy DNA označené fluorescenčním barvivem, kterým může být DAPI..
Vzorek vyžaduje tepelné zpracování k denaturaci dvouvláknové DNA a jejím převedení na dva jednovláknové řetězce. Následně je hybridizován s denaturovanou DNA sondou značenou DAPI, která má sledovanou sekvenci..
Později se promyje, aby se odstranilo to, co nehybridizovalo, kontrast se používá k vizualizaci DNA. Fluorescenční mikroskop umožňuje pozorování hybridizované sondy.
Účelem této techniky je detekovat specifické sekvence v chromozomální DNA a být schopen diagnostikovat určité nemoci.
Tyto cyto-molekulární techniky velmi pomohly při určování podrobností při studiu karyotypů. Například ukázal oblasti bohaté na adenosinové a tyminové páry bází, které se nazývají heterochromatické oblasti nebo pásy DAPI..
Tato technika je široce používána pro studium chromozomů a chromatinu u rostlin a zvířat, jakož i pro diagnostiku prenatálních a hematologických patologií u lidí..
V této technice je doporučená koncentrace DAPI 150 ng / ml po dobu 15 minut..
Sestavená sklíčka by měla být skladována chráněna před světlem při teplotě 2-8 ° C.
Buňky jsou fixovány 4% paraformaldehydem. Pokud se mají použít jiná barviva, ponechá se DAPI na konci jako kontrastní barva a buňky se na 15 minut pokryjí roztokem PBS. Po uplynutí času připravte roztok DAPI zředěním PBS tak, aby konečná koncentrace byla 300 µM.
Poté se přebytečný PBS odstraní a přikryje se DAPI po dobu 5 minut. Několikrát se promyje. Sklíčko je pozorováno ve fluorescenčním mikroskopu pod příslušným filtrem.
S touto sloučeninou je třeba zacházet opatrně, protože jde o sloučeninu, která má mutagenní vlastnosti. Aktivní uhlí se používá k eliminaci této sloučeniny z vodných roztoků, které budou odstraněny..
Aby se zabránilo nehodám s tímto činidlem, musí se používat rukavice, plášť a ochranné brýle. Dojde-li ke kontaktu s pokožkou nebo sliznicemi, je třeba místo umýt dostatečným množstvím vody.
Toto činidlo byste nikdy neměli pipetovat ústy, používejte pipety.
Nekontaminujte činidlo mikrobiálními činidly, protože to povede k chybným výsledkům.
Neřeďte skvrnu DAPI více, než je doporučeno, protože to výrazně sníží kvalitu barvení..
Činidlo nevystavujte přímému světlu ani jej neohřívejte, protože to snižuje fluorescenci.
Zatím žádné komentáře