Médium OF základ, příprava, použití a omezení

4352
Abraham McLaughlin

The médium OF nebo agar pro fermentaci glukózy je polotuhý agar speciálně navržený pro studium oxidativního a fermentačního metabolismu uhlohydrátů v důležité skupině mikroorganismů jiných než Enterobacteriaceae, nazývaných neenterické gramnegativní bacily.

Vytvořili jej Hugh a Leifson; tito vědci si uvědomili, že konvenční způsoby studia produkce kyselin ze sacharidů nejsou pro tuto specifickou skupinu bakterií vhodné.

A. Obchodní bazální médium OF. B. Trubky s OF médiem naočkovaným. Zdroj: A a B Fotografie pořízené autorem MSc. Marielsa Gil.

Důvodem je to, že neenterické gramnegativní tyčinky obecně produkují malé množství kyselin, na rozdíl od Enterobacteriaceae..

V tomto smyslu má médium OF speciální vlastnosti, které dokážou detekovat malá množství vytvořené kyseliny, a to jak oxidační, tak fermentační cestou. Tyto rozdíly souvisejí s množstvím peptonů, sacharidů a agaru..

Toto médium obsahuje méně peptonů a vyšší koncentraci sacharidů, čímž snižuje produkty, které alkalizují médium v ​​důsledku metabolismu bílkovin a zvyšují produkci kyselin v důsledku použití sacharidů..

Na druhou stranu, snížení množství agaru podporuje šíření kyseliny produkované v médiu, kromě toho, že nám umožňuje sledovat pohyblivost.

Médium OF se skládá z peptonu, chloridu sodného, ​​bromthymolové modři, fosforečnanu draselného, ​​agaru a uhlohydrátu. Nejběžnějším sacharidem je glukóza, ale jiné lze použít podle toho, který chcete studovat, například laktózu, maltózu, xylózu..

Rejstřík článků

  • 1 Odůvodnění
    • 1.1 Oxidační proces
    • 1.2 Proces fermentace
  • 2 Příprava
  • 3 použití
    • 3.1 Výsev
    • 3.2 Výklad
  • 4 Kontrola kvality
  • 5 Omezení
  • 6 Reference

Základ

Jako každé kultivační médium, médium OF musí obsahovat výživné látky, které zaručují růst bakterií; tyto látky jsou peptony.

Sacharid zase dodává energii a zároveň slouží ke studiu chování mikroorganismu proti němu, to znamená, že umožňuje klasifikaci bakterií jako oxidativního, fermentačního nebo nesacharolytického organismu..

Médium OF obsahuje poměr pepton / sacharid 1: 5 na rozdíl od běžného média 2: 1. Tím je zajištěno, že množství alkalických aminů vznikajících při degradaci peptonů neutralizuje tvorbu slabých kyselin..

Na druhé straně médium obsahuje chlorid sodný a fosforečnan draselný. Tyto sloučeniny osmoticky stabilizují médium a regulují pH. Bromthymolová modrá je indikátor pH, který mění barvu média ze zelené na žlutou za tvorby kyseliny..

Některé mikroorganismy mohou využívat sacharidy oxidačními nebo fermentačními cestami, zatímco jiné neberou žádnou z těchto dvou cest..

To závisí na vlastnostech každého mikroorganismu. Například některé přísné aerobní mikroorganismy mohou oxidovat určité sacharidy a fakultativní anaeroby mohou oxidovat a fermentovat v závislosti na prostředí kolem nich, zatímco jiné neoxidují ani nefermentují sacharidy (asakrolytické).

Nakonec je zde modifikace média OF doporučeného CDC, která obsahuje speciální OF bázi s fenolovou červení jako indikátor..

Oxidační proces

Proces oxidace glukózy nevyžaduje fosforylaci glukózy, stejně jako proces fermentace. V tomto případě se aldehydová skupina oxiduje na karboxylovou skupinu, což vede k kyselině glukonové. To se zase oxiduje na 2-ketoglukonovou.

Ten se buď hromadí, nebo se rozpadá na dvě molekuly kyseliny pyrohroznové. Tento systém vyžaduje přítomnost kyslíku nebo nějaké anorganické sloučeniny jako konečného akceptoru elektronů..

Produkce kyselin touto cestou je slabší než produkce získaná fermentační cestou.

Proces fermentace

Aby k fermentaci glukózy došlo kteroukoli z dostupných cest, musí být nejprve fosforylována, aby se z ní stal glukóza-6-fosfát..

Glukózová fermentace může probíhat několika způsoby, hlavní cestou je cesta Embden-Meyerhof-Parnas, ale také cestou Entner-Doudoroff nebo cestou hexosacharózy Warburg-Dickens, známou také jako degradace pentóz..

Zvolená cesta bude záviset na enzymatickém systému, který mikroorganismus vlastní..

Přes Embden-Meyerhof- Parnas

Při fermentaci glukózy cestou Embden-Meyerhof-Parnas se štěpí na dvě triozové molekuly, které se poté degradují na různé sloučeniny uhlíku, dokud nedosáhne tvorby glyceraldehyd-3-fosfátu. Odtud vzniká meziprodukt, kterým je kyselina pyrohroznová..

Odtud budou vznikat různé typy směsných kyselin, které se mohou u jednotlivých druhů lišit..

Tento systém se vyskytuje v nepřítomnosti kyslíku a vyžaduje organickou sloučeninu jako konečný akceptor elektronů..

Stezka Entner-Doudoroff

Při fermentaci glukózy cestou Entner-Doudoroff se z 6-fosfátu glukózy stává glukono-ᵼ-lakton-6-fosfát a odtud se oxiduje na 6-fosfoglukonát a 2-keto-3-deoxy-6-fosfoglukonát na nakonec vytvořte kyselinu pyrohroznovou. Tato cesta potřebuje kyslík, aby mohla nastat glykolýza.

Cesta degradace pentózy nebo cesta monofosfátu Warburg-Dickens Hexoxa

Tato trasa je hybridem předchozích 2. Začíná to podobně jako cesta Entner-Doudoroff, ale později se jako předzvěst kyseliny pyrohroznové vytvoří glyceraldehyd-3-fosfát, jak se vyskytuje v cestě Embden-Meyerhof-Parnas..

Příprava

Vážit:

2 g peptonu

5 g chloridu sodného

10 g D-glukózy (nebo připraveného uhlohydrátu)

0,03 g bromthymolové modři

3 g agaru

0,30 g fosforečnanu draselného

1 litr destilované vody.

Smíchejte všechny sloučeniny kromě sacharidů a rozpusťte v 1 litru destilované vody. Zahřejte a protřepávejte, dokud se úplně nerozpustí.

Po ochlazení na 50 ° C přidejte 100 ml 10% glukózy (filtrované).

Asepticky rozdělte 5 ml média OF do zkumavek opatřených bavlnou a autoklávujte při teplotě 121 ° C a tlaku 15 liber po dobu 15 minut.

Necháme ztuhnout ve svislé poloze.

PH média by mělo být 7,1. Barva připraveného média je zelená.

Uchovávejte v chladničce.

Aplikace

Médium OF je speciální médium pro stanovení metabolického chování mikroorganismu vůči sacharidu. Zvláště pro ty, které tvoří málo, slabé nebo žádné kyseliny.

Zaseto

Pro každý mikroorganismus jsou zapotřebí 2 zkumavky OF, obě musí být naočkovány mikroorganismem, který má být studován. Kolonie je odebrána rovnou rukojetí a ve středu trubice je provedeno proražení, aniž by došlo ke dnu; lze provést několik vpichů, pokud není zájem na pozorování pohyblivosti.

Do jedné ze zkumavek se přidá vrstva sterilní tekuté vazelíny nebo sterilního roztaveného parafínu (přibližně 1 až 2 ml), která je označena písmenem „F“. Druhá tuba je ponechána původní a je označena písmenem „O“. Obě zkumavky se inkubují při 35 ° C a pozorují se denně po dobu až 3 až 4 dnů..

Výklad

Metabolismus a produkce plynu

Tabulka: Klasifikace mikroorganismů podle chování v otevřených (oxidačních) a uzavřených (fermentačních) zkumavkách

Zdroj: Autor autor MSc. Marielsa Gil

Plyn je pozorován s tvorbou bublin nebo vytěsňováním agaru.

Je třeba poznamenat, že organismus, který pouze oxiduje glukózu, ale nefermentuje ji, nebude schopen fermentovat ani jiné uhlohydráty, v každém případě ji bude pouze oxidovat. V této situaci bude tedy uzavřená trubice pro studium dalších sacharidů vynechána..

Pohyblivost

Navíc je na médiu OF vidět pohyblivost.

Pozitivní pohyblivost: růst, který se neomezuje pouze na zónu očkování. Po stranách tuby roste.

Negativní pohyblivost: růst pouze v počátečním inokulu.

QA

Jako kontrolu kvality lze použít následující kmeny: Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa Y Moraxella sp. Očekávané výsledky jsou:

  1. coli: Glukózový fermentor (žluté i šumivé zkumavky).
  2. aeruginosa: Okysličovadlo glukózy (žlutá otevřená zkumavka a zelené nebo modré těsnění).
  3. Moraxella sp: Nesacharolytické (zelená nebo modrá otevřená zkumavka, zelená uzavřená zkumavka).

Omezení

-Některé mikroorganismy nemohou růst v médiu OF. V těchto případech se test opakuje, ale do média se přidá 2% séra nebo 0,1% kvasnicového extraktu..

-Oxidační reakce jsou často pozorovány pouze blízko povrchu a zbytek média může zůstat zelený, stejně jako pozitivní.

Reference

  1. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiologická diagnostika. 5. vyd. Redakční Panamericana S.A. Argentina.
  2. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Bailey & Scott mikrobiologická diagnostika. 12 ed. Redakční Panamericana S.A. Argentina.
  3. Mac Faddin J. (2003). Biochemické testy pro identifikaci bakterií klinického významu. 3. vyd. Redakční Panamericana. Buenos Aires. Argentina.
  4. Laboratoře Francisco Soria Melguizo. 2009. OF Glukóza Medium. K dispozici na: http://f-soria.es
  5. Laboratoře Conda Pronadisa. OF glukózového média. K dispozici na: condalab.com
  6. BD Laboratories. 2007. OF Basal Medium. K dispozici na: bd.com

Zatím žádné komentáře