Odůvodnění, technika a použití testu katalázy

3566
Philip Kelley

The katalázový test je metodika používaná v bakteriologických laboratořích k odhalení přítomnosti katalázového enzymu v těch bakteriích, které jej vlastní. Spolu s barvením podle Grama jsou to hlavní testy, které by měly být provedeny na nově izolovaných mikroorganismech. Tyto testy vedou mikrobiologa o krocích, které je třeba dodržet při definitivní identifikaci daného mikroorganismu..

Obecně platí, že bakterie obsahující cytochrom mají enzym katalázu, což znamená, že by jej měly mít fakultativní aerobní a anaerobní bakterie. Existují však výjimky, jako je Streptococcus, které přestože jsou fakultativně anaerobními mikroorganismy, nemají enzym katalázu.

Provedení testu katalázy s pozitivní reakcí. Zdroj: Nebyl poskytnut žádný strojově čitelný autor. Předpokládá se Nase (na základě stížností na porušení autorských práv). [CC BY-SA 3.0 (http://creativecommons.org/licenses/by-sa/3.0/)]

Proto se katalázový test používá hlavně k rozlišení rodin Staphylococaceae a Micrococaceae (obě katalázy pozitivní) od rodiny Streptococaceae (negativní kataláza)..

Podobně se mimo jiné odlišuje rod Bacillus (pozitivní kataláza) od rodu Clostridium (negativní kataláza).

Rejstřík článků

  • 1 Odůvodnění
  • 2 Rutinní technika pro katalázový test
    • 2.1 - Posuvná metoda
    • 2.2 - Přímá metoda v čisté kultuře
    • 2.3 - Metoda s kapilární trubicí nebo Fung a Petrishko
    • 2.4 - Taylorova a Achanzarova metoda pro katalázové testy, které dávají pochybnosti
  • 3 Katalázový test na druhy Mycobacterium
    • 3.1 - Materiály
    • 3.2 - Příprava činidel
    • 3.3 - Postup
  • 4 Použijte
  • 5 Kontrola kvality
  • 6 Omezení
  • 7 Reference

Základ

Kataláza je enzym klasifikovaný jako hydroperoxidáza, to znamená, že používají peroxid vodíku (HdvaNEBOdva).

Považuje se také za oxidoreduktázu, protože v reakci, kde se účastní, existuje prvek, který slouží jako donor elektronů (redukční látka) a další jako elektronový receptor (oxidující látka)..

Kataláza je protein, který obsahuje proserickou skupinu se čtyřmi trojmocnými atomy železa (Fe+++), proto se jedná o homoprotein. Železitý iont zůstává během reakce oxidován.

Lze říci, že kataláza je detoxikační enzym, protože jeho funkcí je eliminovat látky, které jsou produkovány během bakteriálního metabolismu a jsou toxické pro bakterie. Mezi těmito látkami je peroxid vodíku.

Peroxid vodíku vzniká aerobním rozkladem cukrů. K tomuto procesu dochází následovně:

Superoxidový ion (Odva-) (volný radikál) se tvoří jako konečný produkt asimilace glukózy aerobní cestou. To je toxické a je eliminováno enzymem superoxiddismutázou, který ji transformuje na plynný kyslík a peroxid vodíku.

Peroxid vodíku je také toxický pro bakterie a musí být odstraněn. Enzym kataláza štěpí peroxid vodíku na vodu a kyslík.

Kataláza může působit na jiné substráty než peroxid vodíku, jako jsou alkoholy, aldehydy, kyseliny, aromatické aminy a fenoly. Peroxid vodíku však může kataláza použít také k oxidaci jiných toxických sloučenin, jako je methylalkohol a ethylalkohol..

Kataláza je také přítomna ve fagocytických buňkách a chrání ji před toxickým působením peroxidu vodíku..

Rutinní technika pro zkoušku katalázy

-Posuvná metoda

Materiály

3% peroxid vodíku (10 objemů).

Mikroskopický sklíčko

Jednorázová plastová rukojeť nebo dřevěné párátko.

Proces

Vezměte dostatečné množství kolonie ke studiu, aniž byste se dotkli agaru, ze kterého pochází. Kolonie musí být čerstvá, to znamená z kultury 18 až 24 hodin.

Umístěte kolonii na suché sklíčko a přidejte na ni kapku 3% peroxidu vodíku (můžete také použít HdvaNEBOdva 30%). Okamžitě sledujte, zda se bubliny uvolňují nebo ne.

Výklad

Pozitivní reakce: vývoj plynu, o čemž svědčí tvorba bublin (silné probublávání).

Negativní reakce: nedochází k tvorbě bublin.

-Přímá metoda v čisté kultuře

Umístěte 1 ml HdvaNEBOdva 3% na čistou plotnu nebo klínovou kulturu, která neobsahuje krev (nejlépe výživný agar). Pozorujte, zda okamžitě dochází k tvorbě bublin. Můžete také použít HdvaNEBOdva 30%.

Interpretuje se stejně jako metoda objektu porta.

-Kapilární trubice nebo metoda Fung a Petrishko

Naplňte kapilární trubku 67 mm do výšky 20 mm 3% peroxidem vodíku kapilaritou.

Dotkněte se izolované kolonie, která má být studována, kapilárou plnou HdvaNEBOdva na 3%. Sledujte, zda se kapilára naplní bublinami přibližně za 10 sekund. Tato metoda umožňuje semikvantifikaci reakce v kříženích:

Žádné kříže, žádné bubliny (negativní reakce).

+ --Několik bublin (slabá nebo opožděná reakce).

++ -Hojné bubliny (mírná reakce).

+++ -Bubliny dosáhnou opačného extrému (energetická reakce).

-Taylorova a Achanzarova metoda pro pochybné katalázové testy

Na čisté a suché sklíčko umístěte izolovanou kolonii a poté kapku HdvaNEBOdva 0,5% a přikryjte krycím sklíčkem. Sledujte, zda nedochází k tvorbě zachycených bublin.

Interpretace: přítomnost bublin naznačuje pozitivní reakci. Žádné bubliny, je to interpretováno jako negativní reakce.

Test katalázy na druhy Mycobacterium

Tuto techniku ​​je třeba provést kontrolou pH a teploty. Musí být prováděno pod digestoří s laminárním prouděním, protože manipulace s různými druhy Mycobacterium je nebezpečná.

-Materiály

Peroxid vodíku 30% nebo 110 objemů (superoxal).

Fosfátový pufr pH 7

10% Tween 80

Klínová kultura Mycobacterium po dobu 3 až 4 týdnů

-Příprava z činidla

Fosfátový pufr pH 7

Vážit:

1,361 g (KHdvaPO4) bezvodý fosforečnan draselný.

1,420 g bezvodého fosforečnanu disodného (Na2HPO3).

Obě soli se rozpustí v malém množství sterilní destilované vody a doplní se vodou na 1000 ml.

10% Tween 80

Proveďte ředění 1:10 na komerčně koncentrovaný Tween 80, postupujte takto:

Vezměte 1 ml Tween 80 a vložte jej do malého množství destilované vody, rozpusťte a poté doplňte objem vodou do 10 ml.

Konečné činidlo

Smíchejte množství fosfátového pufru s množstvím 10% Tween 80 (ve stejných dílech). Definujte v laboratoři, kolik chcete připravit.

-Proces

Vložte 5 ml fosfátového pufru do sterilní zkumavky se šroubovacím uzávěrem (Bakelite).

Pomocí inokulační smyčky odebrat dostatek kolonií růstu Mycobacterium nasazených v klínech a rozpustit ve fosfátovém pufru.

Trubku uzavřete, aniž byste příliš utáhli závit. Umístěte na 20 až 30 minut do vodní lázně o teplotě 68 ° C. Odstraňte a ochlaďte na 22-25 ° C

Odměřte 0,5 ml výsledného činidla (promíchejte) a přidejte jej do zkumavky se studeným roztokem. Sledujte tvorbu bublin nebo ne.

Je interpretován stejně jako předchozí techniky.

Použití

Pokud je růst kolonií získán v obohaceném médiu, musí být na získaných koloniích provedeno Gramovo barvení a katalázový test. To povede mikrobiologa k postupům, které je třeba dodržet při konečné identifikaci..

Zdroj: Připravil autor MSc. Marielsa Gil

 QA

Pro vyhodnocení dobrého výkonu činidla peroxidu vodíku použijte čerstvě vypěstované kontrolní kmeny, jako např Zlatý stafylokok jako pozitivní kontrola a kmeny Streptococcus sp jako negativní kontrola.

Další alternativou, která slouží jako pozitivní kontrola, je umístit kapku peroxidu vodíku na krevní agar, erytrocyty mají katalázu, proto bude probublávání, pokud je činidlo v dobrém stavu.

Jako negativní kontrolu lze použít čokoládový agar, kde jsou erytrocyty již lyžovány a test je negativní.

Omezení

-Pro test nepoužívejte staré kultury, protože to může vést k falešným negativům.

-Vyvarujte se odebírání kolonií z kultur krevního agaru, pokud dáváte pozor, abyste se agaru nedotkli; tento postup může vést k falešným pozitivům, protože erytrocyty obsahují katalázu.

-Pokud použijete kolínskou platinovou smyčku, neobracejte pořadí postupu, protože by to mohlo vést k falešným pozitivům. Je to proto, že platina je schopna reagovat s peroxidem vodíku a způsobit tak probublávání..

-Nepoužívejte činidlo na bázi peroxidu vodíku, pokud je velmi staré, protože je velmi nestabilní a má sklon se časem rozpadat..

-Činidlo peroxidu vodíku skladujte chráněné před světlem a v chladu, aby nedošlo k poškození..

-Při každém použití proveďte kontrolu kvality činidla peroxidu vodíku.

-Vezměte v úvahu, že pokud HdvaNEBOdva při 30% jsou reakce silnější než reakce prováděné s HdvaNEBOdva na 3%.

Reference

  1. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiologická diagnostika. 5. vyd. Redakční Panamericana S.A. Argentina.
  2. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Bailey & Scott mikrobiologická diagnostika. 12 ed. Redakční Panamericana S.A. Argentina.
  3. Mac Faddin J. (2003). Biochemické testy pro identifikaci bakterií klinického významu. 3. vyd. Redakční Panamericana. Buenos Aires. Argentina.
  4. BD Laboratories. Činidlo kataláza-Gotario. K dispozici na: http://winklerltda.cl
  5. Laboratoře Vadequímica. Peroxid. Ekvivalence mezi objemy a procenty. K dispozici na: vadequimica.com

Zatím žádné komentáře