The Sekvenování DNA (deoxyribonukleová kyselina) je postup prováděný v laboratořích molekulární biologie, který umožňuje znát pořadí nukleotidů v požadovaném genetickém materiálu. Kromě toho lze také odhalit sekvenování RNA (kyselina ribonukleová).
Tato technika byla nepostradatelná pro rozvoj biologických věd. Je také použitelný pro další oblasti znalostí - například lékařskou diagnostiku a forenzní vyšetřování.
Dříve bylo sekvenování řetězce DNA považováno za pomalou a nákladnou aktivitu, která umožňovala identifikaci pouze několika párů bází v oligonukleotidech.
Dnes, se všemi pokroky ve vědě, je sekvenování DNA rutinní operací v mnoha laboratořích po celém světě díky příspěvku téměř 50 let výzkumu v této oblasti. Pokud jde o délku řetězce, ve velmi krátké době lze sekvenovat až miliony párů bází.
K tomu jsou vyvinuty desítky technik, které se liší cenou a přesností. V tomto článku popíšeme klasické i moderní techniky, z nichž každá má své výhody i nevýhody..
Až dosud techniky sekvenování umožňují získat sekvenci úplných genomů, od malých prokaryot a kvasinek až po lidský genom..
Rejstřík článků
Abychom porozuměli metodám a technikám používaným pro sekvenování DNA, je nutné znát určité klíčové aspekty struktury a složení molekuly..
DNA je biomolekula nacházející se ve všem živém, od bakterií po velká vodní zvířata. Organely - jako mitochondrie a chloroplasty - mají uvnitř kruhovou molekulu DNA. I u některých virů je nalezeným genetickým materiálem DNA.
Strukturálně je DNA souborem nukleotidů. Každý z nich je tvořen sacharidem, dusíkatou bází (A, T, C nebo G) a fosfátovou skupinou. Cílem sekvenování DNA je odhalit pořadí, ve kterém se v sekvenci nacházejí čtyři dusíkaté báze..
V polovině 50. let popsali vědci Watson a Crick strukturu DNA pomocí christolografických technik. Žádný z těchto vědců však nebyl schopen najít způsob, jak tuto sekvenci rozluštit..
I když existovali jistí předchůdci, nejdůležitější událostí bylo vytvoření Sangerovy metody, v roce 1977. Frederick Sanger, otec této metody, byl britský biochemik, vítěz dvou Nobelových cen za enormní přínos biologickým vědám..
Tato technika je v literatuře známá také jako „ukončení řetězce“ nebo dideoxynukleotidy. Níže budou popsány principy této techniky a ty, které byly vyvinuty na základě zdokonalení a inovace této techniky..
Vývoj Sangerovy metody představoval zásadní událost v molekulární biologii. Zahrnuje základní složky procesu replikace DNA, které se normálně vyskytují v buňce, ale přidává speciální složku: dideoxynukleotidy.
- DNA polymeráza: enzym DNA polymeráza je klíčovým prvkem procesu. Tato molekula se podílí na replikaci řetězce DNA a její úlohou je syntéza nového řetězce, párování trifosfátdeoxyribonukleotidů s komplementárními..
Připomeňme, že v DNA se tyminy (T) párují s adeniny (A) dvěma vodíkovými vazbami, zatímco cytosin (C) to dělá s guaninem (G) třemi můstky..
- Nukleotidy: Sangerovo sekvenování zahrnuje dva typy nukleotidů, čtyři 2'-deoxynukleotidy (zkráceně dATP, dGTP, dCTP a dTTP) a čtyři speciální dideoxynukleotidy (ddATP, ddGTP, ddCTP a ddTTP)..
Ačkoli jsou dideoxynukleotidy podobné monomerům, které jsou normálně inkorporovány do DNA, postrádá ve své struktuře skupinu -OH. To znemožňuje přidání nového nukleotidu do řetězce..
Proto když je do formovaného řetězce přidán - zcela náhodným způsobem - speciální nukleotid, syntéza je paralyzována. Tímto způsobem na konci reakce existují řetězce různých velikostí, z nichž každý byl zastaven v jiném bodě..
Experimentálně jsou připraveny čtyři testy. Každý obsahuje DNA extrahovanou z požadovaného biologického vzorku, normální nukleotidy a jeden ze čtyř speciálních typů nukleotidů. Nebo jsou speciální nukleotidy označeny nějakým typem fluorescenčního markeru (viz automatické sekvenování níže).
Prvním krokem je oddělení každého ze syntetizovaných řetězců podle jejich velikosti. Některé budou delší než jiné, podle toho, kde byly zabudovány speciální základny..
Existují různé biochemické techniky, které umožňují oddělení složek směsi pomocí velikosti jako diskriminační vlastnosti. V Sangerově metodě jsou různé řetězce odděleny elektroforézou. Ve složitějších variantách techniky se používá kapilární elektroforéza.
Delší prameny tedy cestují méně než kratší varianty. Tento systém poté prochází čtečkou, která rozpoznává marker obsažený v každém dideoxynukleotidu. Tímto způsobem lze znát pořadí sekvence.
Tato technika „první generace“ je schopná číst fragmenty DNA o velikosti nejvýše 1 kilobáze. V současné době se Sangerova metoda používá v různých laboratořích, obecně v jejích moderních variantách. Kromě toho se používá k potvrzení výsledků získaných nejsložitějšími technikami - ale méně přesnými..
Pokud je sekvenování vyžadováno ve velkém měřítku, proces je urychlen automatizací. Jedná se o variantu metody ukončení řetězce Sanger, kde jsou primery označeny fluorescenčními produkty, aby se odlišily..
Následně se reakční produkt provádí elektroforézou - vše v jedné dráze. Když každý fragment opustí finální část gelu, je rychle identifikován podle fluorescenčního značení s chybou kolem 1%..
Nejsofistikovanější systémy mají systém až 96 kapilárních trubic řízený počítačem spojeným s robotem. To znamená, že lze současně testovat 96 vzorků DNA. Proces zahrnující elektroforézu a analýzu výsledků je tedy plně automatizovaný..
Za jeden den mohou tyto systémy sekvenovat až 550 000 bází. Během procesu je lidská práce zbytečná, spuštění metody trvá jen asi 15 minut.
Ve stejné době, kdy Sanger publikoval svou práci, se dvěma vědcům jménem Allan Maxan a Walter Gilbert podařilo vyvinout další metodu pro získání sekvence DNA. Metoda získala v té době popularitu, ale později byla přemístěna vylepšením Sangerovy metody..
Na rozdíl od Sangerovy metody Maxan a Gilbertovo sekvenování (nebo chemické sekvenování, jak je také známé) nezahrnuje hybridizační reakce. Metodika spočívá v značení reaktivními činidly na jednom konci a následném procesu čištění..
Jeden z negativních aspektů této techniky spočívá v její nesmírné složitosti a v používání chemikálií, které jsou pro uživatele nebezpečné. Chemické poruchy jsou vyvolávány aplikací DMS, kyseliny mravenčí, hydrazinu a hydrazinu se solemi.
Protokol začíná značením na 5 'konci řetězce fosforovým markerem 32, poté nastává chemická modifikace dusíkaté báze a je oddělena. Nakonec nastává štěpení abasické oblasti.
Nejprve se řetěz, který má být sekvenován, zkrátí na menší segmenty. Tento krok se provádí restrikčními enzymy, jejichž výsledkem jsou vyčnívající konce..
Dále se reakce provádí s alkalickou fosfatázou, jejímž účelem je eliminace fosfátové skupiny. Polynukleotid kinázu lze tedy použít k provedení značení..
Řetěz je denaturovaný (dva prameny otevřené). Poté se aplikují chemikálie. Tyto štěpné reakce se provádějí řízeným způsobem a je známo, jaké typy vazeb se každá použitá chemická látka rozbije..
Stejně jako v Sangerově metodě zahrnuje odečítání výsledků separaci podle velikosti řetězců získaných v elektroforetickém systému. Systémy složené z polyakrylamidu umožňují získat velmi adekvátní rozlišení pro čtení gelu.
Hromadné řazení zahrnuje řadu nových metod, zkráceně NGS, z angličtiny.Sekvenování příští generace ".
Metody klasifikované jako NGS vyžadují předchozí krok amplifikace DNA (nepracují s jedinou molekulou). Použité platformy se navíc velmi liší. Principy nejpopulárnějších metod budou popsány níže:
Zahrnuje monitorování uvolňování pyrofosfátu, ke kterému dochází pokaždé, když je do řetězce DNA přidán nový nukleotid. Enzymový systém je spojen, takže k emisi světla (které je detekovatelné kamerou) dochází pokaždé, když je začleněn nový nukleotid.
Proces začíná samostatnou inkubací každé dusíkaté báze, aby se ověřilo, zda existuje či neexistuje emise světla. Pyrosekvenování může číst dlouhé řetězce, ale zjištěná chybovost je vysoká.
To zahrnuje začlenění značených nukleotidů. Tyto fluorescenční složky se přidají, promyjí a zaznamená se začleněný nukleotid. Poté je nukleotidová značka odstraněna a syntéza vlákna může pokračovat. V dalším kroku bude také začleněn značený nukleotid a výše uvedené kroky budou opakovány..
Nevýhoda této techniky nastává, když fluorescenční markery nejsou zcela odstraněny. Tyto emise vytvářejí chyby pozadí, což vede k významným chybám.
Tato technika se liší od ostatních, protože nepoužívá DNA polymerázu. Místo toho je klíčovým enzymem pro tuto metodiku ligáza. Zde se používají fluorescenčně značené fragmenty DNA, je ligován enzymem a je detekován.
Největším problémem této techniky je krátká délka fragmentu, kterou je schopen zpracovat..
Tato technika je založena na měření H iontu+ který se uvolní pokaždé, když je začleněn nový nukleotid. Princip je docela podobný pyrosekvenování, ale mnohem levnější.
Sekvenování lidského genomu bylo jednou z nejslibnějších výzev biologie a zároveň jednou z nejuznávanějších soupeření v historii vědy. Ve skutečnosti se pro vědce zapojené do projektu stalo sekvenování genomu konkurencí..
V roce 1990 zahájil takzvaný „projekt lidského genomu“, vedený slavným vědcem, nositelem Nobelovy ceny, Jamesem Watsonem. Po roce, v roce 1991, se Venter chopil výzvy „porazit“ Watsona a sekvenovat genom před ním. V roce 1992 však Watson odešel do důchodu a velení převzal jiný výzkumník.
V roce 1995 Venter oznámil svůj úspěch v úplném sekvenování bakteriálního genomu metodou náhodného sekvenování. Podobně soupeřův tým o rok později oznámil sekvenování genomu kvasinek..
V roce 2000 byl závod ukončen. Obě společnosti zveřejnily své předběžné výsledky celého genomu ve dvou nejprestižnějších vědeckých časopisech: Příroda Y Věda.
Vědci však pokračovali v práci na zdokonalování návrhů a v roce 2006 byly dokončeny sekvence určitých lidských chromozomů..
Znát pořadí nukleotidů molekuly tak důležité jako DNA je cenné pro biology a příbuzné odborníky. Tento řetězec polynukleotidů obsahuje všechny informace nezbytné pro vývoj a údržbu všech forem života..
Z těchto důvodů je znalost této sekvence nezbytná pro biologický výzkum. Sekvenování v zásadě umožňuje měřit jednu z nejdůležitějších vlastností biologických systémů a stanovit mezi nimi rozdíly..
Sekvenování je široce používáno taxonomy a systematisty, protože určité sekvence DNA umožňují stanovit kritéria k závěru, zda dva organismy patří ke stejnému druhu, nebo kromě toho, že mohou navrhovat hypotézy o fylogenetických vztazích mezi nimi..
Sekvenování DNA má navíc aplikace v medicíně a diagnostice. Například existují levné a přístupné systémy, které prostřednictvím sekvenování umožňují vyhodnotit tendenci k rozvoji určitých onemocnění (jako je rakovina) pomocí takzvaných jednonukleotidových polymorfismů (SNP)..
Kriminalistické a forenzní vyšetřování bylo také obohaceno o techniky sekvenování, které lze použít jako spolehlivý důkaz účasti určité osoby na trestném činu.
Zatím žádné komentáře